Summary

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

Abstract

הקוליקולוס העליון (SC), מבנה מוח אמצעי שנשמר אבולוציונית אצל כל בעלי החוליות, הוא מרכז הראייה המתוחכם ביותר לפני הופעתה של קליפת המוח. הוא מקבל קלט ישיר מ ~ 30 סוגים של תאי גנגליון רשתית (RGCs), כאשר כל אחד מהם מקודד תכונה חזותית ספציפית. עדיין לא ברור אם ה-SC פשוט יורש תכונות רשתית או אם מתרחש עיבוד נוסף ופוטנציאלי דה נובו ב-SC. כדי לחשוף את הקידוד העצבי של מידע חזותי ב-SC, אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט לרישום אופטי של תגובות חזותיות בשתי שיטות משלימות בעכברים ערים. שיטה אחת משתמשת במיקרוסקופ של שני פוטונים כדי לדמות פעילות סידן ברזולוציה של תא בודד מבלי לבעור את קליפת המוח המכסה אותו, ואילו השיטה השנייה משתמשת במיקרוסקופ רחב שדה כדי לצלם את כל ה-SC של עכבר מוטנטי שקליפת המוח שלו אינה מפותחת ברובה. פרוטוקול זה מפרט את שתי השיטות הללו, כולל הכנת בעלי חיים, הזרקה ויראלית, השתלת לוחית ראש, השתלת תקעים, איסוף נתונים וניתוח נתונים. התוצאות המייצגות מראות כי הדמיית הסידן של שני פוטונים חושפת תגובות עצביות מעוררות חזותית ברזולוציה של תא יחיד, והדמיית הסידן בשדה רחב חושפת פעילות עצבית על פני כל ה-SC. על-ידי שילוב שתי השיטות הללו, ניתן לחשוף את הקידוד העצבי ב-SC בקני מידה שונים, ושילוב כזה יכול להיות מיושם גם על אזורי מוח אחרים.

Introduction

הקוליקולוס העליון (SC) הוא מרכז ראייה חשוב בכל בעלי החוליות. ביונקים הוא מקבל קלט ישיר מהרשתית ומקליפת המוח הראייתית1. בעוד שהקלטה אופטית יושמה באופן נרחב על קליפת המוח 2,3,4,5, היישום שלה ב-SC מעוכב על ידי גישה אופטית גרועה 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. מטרת פרוטוקול זה היא לספק פרטים על שתי שיטות משלימות לרישום אופטי של הפעילות העצבית ב-SC.

ה-SC ממוקם מתחת לקליפת המוח ולסינוס הרוחבי, מה שמגביל את הגישה האופטית לנוירונים הקוליקולריים. גישה אחת להתגבר על מגבלה זו היא לשאוף את קליפת המוח המכסה ולחשוף את SC 7,9,10,13,14,19 הקדמי-לטרלי. אולם מאחר שה-SC מקבל קלט מקליפת המוח, פעולה כזו עשויה להשפיע על האופן שבו תאי העצב מסוג SC מגיבים לגירויים חזותיים. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מפרטים כאן פרוטוקול חלופי להדמיה של השכבה השטחית של SC האחורי-מדיאלי עם תקע סיליקון, תוך השארת קליפת המוח שלמה 8,11. באופן ספציפי, כדי להשיג רזולוציה של תא יחיד, השתמשנו במיקרוסקופ של שני פוטונים כדי לדמיין תגובות סידן ב-SC האחורי-מדיאלי של עכברי בר. בנוסף, כדי להשיג כיסוי רחב, השתמשנו במיקרוסקופ רחב שדה כדי לצלם את כל ה-SC של עכבר מוטנטי שקליפת המוח האחורית שלו לא התפתחה20.

שתי השיטות המתוארות בפרוטוקול זה משלימות זו את זו. הדמיית סידן של שני פוטונים ללא שריפה של קליפת המוח מתאימה לרישום פעילות עצבית ברזולוציה של תא בודד עם קלט קליפת המוח השלם. הדמיית הסידן רחבת השדה מתאימה לרישום הפעילות העצבית ב-SC כולו תוך הקרבת הרזולוציה המרחבית.

Protocol

כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם להנחיות רווחת בעלי החיים ואושרו על ידי IACUC במכון הסיני לחקר המוח, בייג’ינג. הערה: ציר הזמן עבור פרוטוקול זה הוא כדלקמן: 1) להכין את היניקה; 2) להזריק את הנגיף; 3) להשתיל את לוחית הראש; 4) לאחר 3 שבועות, להשתיל את התקע; 5) לאחר ~3 ימי התאוששות והתרגלות על ההלי?…

Representative Results

איורים 1A,B מראים כיצד ליצור את היניקה ואת התקעים, בהתאמה. איור 2 מראה כיצד להשתיל את התקע בהצלחה. לאחר השתלת התקע, ה-SC האחורי-מדיאלי נחשף, כפי שמוצג באיור 2D. איור 3 מראה תגובות סידן של תאי עצב מסוג SC מעכבר פראי לדוגמה שצו…

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
השלב הקריטי ביותר הוא קרניוטומיה בשלבים 5.2 ו -5.3. ראשית, העצם ב-0.5 מ”מ אחורית ללמדא עבה ובתוכה כלי דם, מה שעלול לגרום לדימום בתהליך הקידוח. קצף ג’ל הולם צריך להיות מוכן לעצור את הדימום. שנית, יש סיכוי טוב לאנגיורקסיס בעת הסרת העצם ממש מעל הסינוס הרוחבי. לפתרון …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32271060). י.-ת.ל. תכנן את המחקר, ביצע את הניסוי, ניתח את הנתונים וכתב את כתב היד. ז.ל. ור.ו. ביצעו את הניסוי.

Materials

16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

References

  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
  4. Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
  5. de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
  6. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
  7. Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
  8. Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
  9. Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
  10. de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
  11. Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
  12. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
  13. Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
  14. Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
  15. Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
  16. Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
  17. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
  18. Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
  19. Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
  20. Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
  21. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
  22. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  23. Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
  24. Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
  25. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  26. Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).

Play Video

Cite This Article
Li, Z., Wu, R., Li, Y. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

View Video