Выделение внеклеточных везикул с низким содержанием эндотоксинов, полученных из линий раковых клеток

Внеклеточные везикулы (ВВ), согласно номенклатуре MISEV 2018, являются собирательным термином, описывающим различные подтипы секретируемых клетками мембранных везикул, которые играют решающую роль в многочисленных физиологических и патологических процессах ^1,2. Кроме того, электромобили обещают стать новыми биомаркерами различных заболеваний, а также терапевтическими агентами и средствами доставки лекарств. Однако реализовать весь их потенциал сложно, так как все еще существует множество технических препятствий, связанных с их приобретением³. Одной из таких проблем является выделение электромобилей, не содержащих эндотоксинов, которым во многих случаях пренебрегают. Одним из наиболее распространенных эндотоксинов является липополисахарид (ЛПС), который является основным компонентом грамотрицательных бактериальных клеточных стенок и может вызывать острую воспалительную реакцию из-за высвобождения различными клетками большого количества воспалительных цитокинов ^4,5. ЛПС индуцирует реакцию путем связывания с ЛПС-связывающим белком с последующим взаимодействием с комплексом CD14/TLR4/MD2 на миелоидных клетках. Это взаимодействие приводит к активации MyD88- и TRIF-зависимых сигнальных путей, что, в свою очередь, запускает ядерный фактор каппа В (NFkB). Транслокация NFkB в ядро инициирует продукцию цитокинов⁶. Моноциты и макрофаги очень чувствительны к ЛПС, и их воздействие на ЛПС приводит к высвобождению воспалительных цитокинов и хемокинов (например, IL-6, IL-12, CXCL8 и TNF-α)^7,8. Структура CD14 позволяет связывать различные виды ЛПС с одинаковым сродством и служит корецептором для других толл-подобных рецепторов (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 и 9)⁶. Количество исследований, проводимых о влиянии ЭВ на моноциты/макрофаги, все еще увеличивается 9,10,11. Особенно с точки зрения изучения функций моноцитов, их субпопуляций и других иммунных клеток большое значение имеет наличие эндотоксина и даже их замаскированное присутствие в ВВ¹². Упущенное из виду загрязнение электромобилей эндотоксинами может привести к вводящим в заблуждение выводам и скрыть их истинную биологическую активность. Другими словами, работа с моноцитарными клетками требует уверенности в отсутствии загрязнения эндотоксинами¹³. Потенциальными источниками эндотоксинов могут быть вода, коммерчески получаемые среды и сыворотки, компоненты и добавки сред, лабораторная стеклянная посуда и пластмассовая посуда 5,14,15.

Таким образом, это исследование было направлено на разработку протокола выделения ВВ с низким содержанием эндотоксина. Протокол содержит простые подсказки о том, как избежать загрязнения эндотоксинами во время изоляции электромобилей вместо удаления эндотоксинов из электромобилей. Ранее было представлено множество протоколов о том, как удалять эндотоксины, например, из инженерных наночастиц, используемых в наномедицине; однако ни один из них не полезен для биологических структур, таких как электромобили. Эффективное депирогенирование наночастиц может быть осуществлено промывкой этанолом или уксусной кислотой, нагреванием при 175 °C в течение 3 ч, облучением γ или обработкой тритоном X-100; однако эти процедуры приводят к разрушению ЭВ^16,17.

Представленный протокол является новаторским исследованием, направленным на предотвращение примесей эндотоксина в EV, в отличие от предыдущих исследований о влиянии EV на моноциты⁹. Применение предложенных принципов в лабораторной практике может помочь получить надежные результаты исследований, что может иметь решающее значение при рассмотрении потенциального использования ЭВ в качестве терапевтических агентов в клинике¹².