Isolamento de Vesículas Extracelulares de Baixo Conteúdo de Endotoxinas Derivadas de Linhagens Celulares Cancerígenas

Vesículas extracelulares (EVs), de acordo com a nomenclatura MISEV 2018, são um termo coletivo que descreve vários subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempenham papéis cruciais em inúmeros processos fisiológicos e patológicos ^1,2. Além disso, os EVs mostram-se promissores como novos biomarcadores para várias doenças, bem como agentes terapêuticos e veículos de liberação de medicamentos. No entanto, realizar todo o seu potencial é difícil, pois ainda existem muitos obstáculos técnicos relacionados à sua aquisição³. Um desses desafios é o isolamento de EVs livres de endotoxinas, que tem sido negligenciado em muitos casos. Uma das endotoxinas mais comuns é o lipopolissacarídeo (LPS), que é um dos principais componentes da parede celular de bactérias gram-negativas e pode causar uma resposta inflamatória aguda, devido à liberação de um grande número de citocinas inflamatórias por várias células ^4,5. O LPS induz uma resposta por ligação à proteína ligadora do LPS, seguida de interação com o complexo CD14/TLR4/MD2 em células mieloides. Essa interação leva à ativação das vias de sinalização dependentes de MyD88 e TRIF, que por sua vez desencadeiam o fator nuclear kappa B (NFkB). A translocação do NFkB para o núcleo inicia a produção de citocinas⁶. Monócitos e macrófagos são altamente sensíveis ao LPS, e sua exposição ao LPS resulta em uma liberação de citocinas inflamatórias e quimiocinas (por exemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 e TNF-α)^7,8. A estrutura CD14 permite a ligação de diferentes espécies de LPS com afinidade semelhante e serve como co-receptor para outros receptores toll-like (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 e 9)⁶. O número de estudos sendo conduzidos sobre os efeitos dos EVs em monócitos/macrófagos ainda está aumentando 9,10,11. Especialmente do ponto de vista do estudo das funções dos monócitos, suas subpopulações e outras células imunes, a presença de endotoxina e mesmo sua presença mascarada em EVs é de grande importância¹². A contaminação negligenciada de EVs com endotoxinas pode levar a conclusões enganosas e ocultar sua verdadeira atividade biológica. Em outras palavras, trabalhar com células monocíticas requer confiança na ausência de contaminação por endotoxinas¹³. Fontes potenciais de endotoxinas podem ser água, meios e soros obtidos comercialmente, componentes e aditivos de meios, vidraria de laboratório e plasticware 5,14,15.

Portanto, este estudo teve como objetivo desenvolver um protocolo para o isolamento de EVs com baixo teor de endotoxinas. O protocolo fornece dicas simples sobre como evitar a contaminação por endotoxinas durante o isolamento de EVs em vez de remover endotoxinas de EVs. Anteriormente, muitos protocolos foram apresentados sobre como remover endotoxinas de, por exemplo, nanopartículas projetadas usadas em nanomedicina; no entanto, nenhum deles é útil para estruturas biológicas como EVs. A despirogenação efetiva das nanopartículas pode ser realizada por enxágue com etanol ou ácido acético, aquecimento a 175 °C por 3 h, irradiação γ ou tratamento com triton X-100; entretanto, esses procedimentos levam à destruição dos EVs^16,17.

O protocolo apresentado é um estudo pioneiro focado em evitar impurezas de endotoxinas em EVs, ao contrário de estudos anteriores sobre o efeito de EVs em monócitos9. A aplicação dos princípios propostos à prática laboratorial pode auxiliar na obtenção de resultados confiáveis de pesquisa, o que pode ser crucial quando se considera o potencial uso dos EVs como agentes terapêuticos na clínica¹².