암 세포주에서 유래한 낮은 내독소 함량 세포외 소포의 분리
Summary
제안된 프로토콜에는 세포 배양 상층액에서 세포외 소포를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다.
Abstract
세포외 소포(EV)는 시험관 내 및 생체 내 세포에서 방출되는 이질적인 막 소포 집단입니다. 그들의 편재성과 생물학적 정보의 운반자로서의 중요한 역할은 그들을 흥미로운 연구 대상으로 만들고 분리를 위해 신뢰할 수 있고 반복적인 프로토콜이 필요합니다. 그러나 연구와 관련된 많은 기술적 장애물(예: 적절한 획득)이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다. 이 연구는 차등 원심분리를 기반으로 하는 종양 세포주의 배양 상층액에서 소형 EV(MISEV 2018 명명법에 따름)를 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 EV를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. EV의 내독소 오염은 후속 실험을 크게 방해하거나 실제 생물학적 효과를 가릴 수도 있습니다. 반면에, 내 독소의 간과 된 존재는 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 이것은 단핵구를 포함한 면역계의 세포를 언급 할 때 특히 중요한데, 이는 단핵구가 내 독소 잔기에 특히 민감한 집단을 구성하기 때문입니다. 따라서 특히 단핵구, 대식세포, 골수 유래 억제 세포 또는 수지상 세포와 같은 내독소에 민감한 세포로 작업할 때 EV의 내독소 오염을 스크리닝하는 것이 좋습니다.
Introduction
MISEV 2018 명명법에 따르면 세포외 소포(EV)는 수많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 세포 분비 막낭의 다양한 하위 유형을 설명하는 집합적인 용어입니다 1,2. 또한 EV는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커, 치료제 및 약물 전달 수단으로서의 가능성을 보여줍니다. 그러나 인수와 관련된 기술적 장애물이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다3. 이러한 과제 중 하나는 많은 경우 무시되어 온 내독소가 없는 EV의 분리입니다. 가장 흔한 내독소 중 하나는 지질다당류(LPS)로, 그람 음성 박테리아 세포벽의 주요 구성 요소이며 다양한 세포에 의한 많은 수의 염증성 사이토카인의 방출로 인해 급성 염증 반응을 일으킬 수 있습니다 4,5. LPS는 LPS 결합 단백질에 결합한 후 골수 세포에서 CD14/TLR4/MD2 복합체와 상호작용하여 반응을 유도합니다. 이 상호 작용은 MyD88 및 TRIF 의존성 신호 전달 경로의 활성화로 이어지며, 이는 차례로 핵 인자 카파 B(NFkB)를 유발합니다. NFkB의 핵으로의 전좌는 사이토카인의 생산을 개시한다6. 단핵구와 대식세포는 LPS에 매우 민감하며 LPS에 노출되면 염증성 사이토카인과 케모카인(예: IL-6, IL-12, CXCL8 및 TNF-α)이 방출됩니다7,8. CD14 구조는 유사한 친화도를 갖는 상이한 LPS 종의 결합을 가능하게 하고, 다른 톨-유사 수용체 (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 및 9)에 대한 공동-수용체로서 작용한다6. 단핵구/대식세포에 대한 EV의 영향에 대한 연구의 수는 여전히 증가하고 있습니다 9,10,11. 특히 단핵구, 그 하위 집단 및 기타 면역 세포의 기능을 연구하는 관점에서 볼 때, 내독소의 존재와 EV에서 가려진 존재는 매우 중요합니다12. 내독소로 인한 EV의 간과된 오염은 오해의 소지가 있는 결론으로 이어지고 진정한 생물학적 활성을 숨길 수 있습니다. 즉, 단핵구 세포로 작업하려면 내독소 오염이 없다는 확신이 필요합니다13. 내독소의 잠재적 공급원은 물, 상업적으로 입수된 배지 및 혈청, 배지 성분 및 첨가제, 실험실 유리 제품 및 플라스틱 제품일 수 있다 5,14,15.
따라서 본 연구는 저내독소 함유 EV의 분리를 위한 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 이 프로토콜은 EV에서 내독소를 제거하는 대신 EV 격리 중에 내독소 오염을 피하는 방법에 대한 간단한 힌트를 제공합니다. 이전에는 예를 들어 나노 의학에 사용되는 조작 된 나노 입자에서 내 독소를 제거하는 방법에 대한 많은 프로토콜이 제시되었습니다. 그러나 이들 중 어느 것도 EV와 같은 생물학적 구조에 유용하지 않습니다. 나노 입자의 효과적인 발열원 제거는 에탄올 또는 아세트산 헹굼, 175 °C에서 3 시간 동안 가열, γ 조사 또는 트리톤 X-100 처리에 의해 수행 될 수 있습니다. 그러나 이러한 절차는 EV16,17의 파괴로 이어집니다.
제시된 프로토콜은 단핵구에 대한 EV의 효과에 대한 이전 연구와 달리 EV의 내독소 불순물을 피하는 데 초점을 맞춘 선구적인 연구입니다9. 제안된 원리를 실험실 실습에 적용하면 신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 클리닉에서 치료제로서 EV의 잠재적 사용을 고려할 때 중요할 수 있다12.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 몇 년 동안, 적절한 전기차 분리를 위한 방법들이 점점 더 중요해졌으며, 예를 들어, 신뢰할 수 있는 오믹스 및 기능 데이터를 얻는 맥락에서 더욱 신뢰할 수 있는 분석이 가능해졌다24. 이전 연구 경험에 비추어 볼 때, 격리 방법의 유형뿐만 아니라이 절차 중 다른 조건도 중요 할 수 있습니다. EV-고갈 FBS의 사용은 필요성으로 널리 인식되고 있다25,26</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 폴란드 국립 과학 센터(National Science Centre)의 보조금 번호 2019/33/B/NZ5/00647의 지원을 받았습니다. EV에서 박테리아 DNA를 검출하는 데 귀중한 도움을 주신 Jagiellonian University Medical College의 분자 의료 미생물학과의 Tomasz Gosiewski 교수와 Agnieszka Krawczyk 교수에게 감사드립니다.
Materials
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
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