Standardisering av överföring mellan laboratorier mellan flödescytometrar för detektion av lymfocyter hos japanska encefalitvaccinerade barn
Summary
I denna studie utvecklades en metod för att underlätta överföring av experimentella inställningar och analysmallar mellan två flödescytometrar i två laboratorier för detektion av lymfocyter hos japanska encefalitvaccinerade barn. Standardiseringsmetoden för flödescytometerexperimenten gör det möjligt att effektivt genomföra forskningsprojekt i flera centra.
Abstract
Ett ökande antal laboratorier behöver samla in data från flera flödescytometrar, särskilt för forskningsprojekt som utförs över flera centra. Utmaningarna med att använda två flödescytometrar i olika laboratorier inkluderar bristen på standardiserade material, programvarukompatibilitetsproblem, inkonsekvenser i instrumentinställningar och användningen av olika konfigurationer för olika flödescytometrar. För att etablera ett standardiserat flödescytometriexperiment för att uppnå konsistens och jämförbarhet av experimentella resultat över flera centra etablerades en snabb och genomförbar standardiseringsmetod för att överföra parametrar över olika flödescytometrar.
Metoderna som utvecklades i denna studie möjliggjorde överföring av experimentella inställningar och analysmallar mellan två flödescytometrar i olika laboratorier för detektion av lymfocyter hos japanska encefalit (JE)-vaccinerade barn. En konsekvent fluorescensintensitet erhölls mellan de två cytometrarna med hjälp av fluorescensstandardpärlor för att fastställa cytometerinställningarna. Jämförbara resultat erhölls i två laboratorier med olika typer av instrument. Med hjälp av denna metod kan vi standardisera analys för utvärdering av immunfunktionen hos JE-vaccinerade barn i olika laboratorier med olika instrument, minska skillnaderna i data och resultat mellan flödescytometrar i flera centra och ge ett genomförbart tillvägagångssätt för ömsesidig ackreditering av laboratorieresultat. Standardiseringsmetoden för flödescytometerexperiment kommer att säkerställa ett effektivt utförande av forskningsprojekt över flera centra.
Introduction
Standardiseringen av flödescytometri är användbar för jämförbarheten av resultat erhållna från olika cytometrar över olika laboratorier och studiecentra och bidrar till ömsesidigt erkännande av resultat för att förbättra arbetseffektiviteten. Allt fler scenarier kräver standardisering. Under läkemedelsutvecklingsprocessen är standardisering av flödescytometri viktig, eftersom en utvecklad och validerad analys kommer att stödja hela läkemedelsutvecklingsprocessen från preklinisk till klinisk analys. Flödescytometriska metoder överförs ofta mellan läkemedelsindustrin och samarbetande laboratorier1. Dessutom är det viktigt att få jämförbara data från multicentriska kliniska studier. Till exempel utvecklades ett standardiseringsarbetsflöde i Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project för att erhålla jämförbara data från multicentrisk flödescytometri2.
Standardiseringen av flödescytometrimetoder är utmanande. De utmaningar som upplevs i laboratorier tillskrivs bristen på standardiserade material, programvarukompatibilitetsproblem, inkonsekvenser i instrumentinställningar och användningen av olika konfigurationer mellan olika flödescytometrar och divergerande grindstrategier mellan centren 3,4. Därför är det viktigt att göra en gapanalys mellan laboratorier. Provåtkomst, kvalitetssystem, personalkvalifikationer och instrumentkonfiguration måste granskas för att säkerställa att kraven uppfylls.
För närvarande har barn som vaccinerats med vaccinet mot japansk encefalit (JE) en signifikant minskad förekomst av JE5. Övervakning av perifera blodimmunceller kan hjälpa till att förstå förändringarna i cellmedierad adaptiv immunitet efter vaccination och korrelationen mellan förändringarna i perifera blodlymfocytundergrupper och effekterna av vaccination. På grund av den begränsade stabiliteten hos helblodprover utförs ofta utvärderingar av vaccinets effektivitet i flera centra. För denna analys definierade vi naiva CD8 + eller CD4 + T-celler som CD27 + CD45RA +, centrala minnes-T-celler (T CM) som CD27 + CD45RA-, effektorminnes-T-celler (TEM) som CD27- CD45RA–, och terminalt differentierade effektorminnes-T-celler (TEMRA) som CD27– CD45RA +. CD19 + B-celler kan separeras i populationer som uttrycker CD27 kontra IgD 6,7, naiva B-celler uttrycker CD27n-minne B-celler (mBC) kan identifieras baserat på uttrycket av IgD6 och regulatoriska T-celler (Tregs) kan identifieras som CD4 + CD25 + + CD127låg 8. För att etablera ett standardiserat flödescytometriexperiment för att uppnå konsistens och jämförbarhet av experimentella resultat i flera centra etablerades en snabb och genomförbar standardiseringsmetod för att underlätta överföringen av protokoll över olika flödescytometrar för detektion av lymfocyter i helblod hos JE-vaccinerade barn. Sex friska barn (2 år) rekryterades från Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University. Efter att ha fått en prime- och boost-vaccination med ett levande försvagat JE SA14-14-2-vaccin mindre än 6 månader tidigare samlades perifera blodprover från volontärerna. Mycket jämförbara data erhölls från olika instrument efter standardiserade procedurer, vilket är till hjälp för multicenterbedömningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunofenotypning av undergrupper av perifera lymfocyter kan hjälpa till att förstå förändringarna i cellmedierad adaptiv immunitet efter vaccination hos barn. I kliniska tillämpningar uppstår oväntade situationer, såsom underlåtenhet att upptäcka prover i tid eller ersättning av en flödescytometer; Därför behövs snabba standardiserade metoder som underlättar överföringar mellan flödescytometrar i olika laboratorier 9,10,11.<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RW stöddes av Beijing Natural Science Foundation, Kina (nr 7222059), National Natural Science Foundation of China (nr 82002130), XZ stöddes av CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr 2019-I2M-5-026).
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
