Normalisation du transfert entre laboratoires entre cytomètres en flux pour la détection des lymphocytes chez les enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise
Summary
Dans cette étude, une méthode a été développée pour faciliter le transfert de contextes expérimentaux et de modèles d’analyse entre deux cytomètres en flux dans deux laboratoires pour la détection des lymphocytes chez les enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise. La méthode de normalisation des expériences de cytomètre en flux permettra de mener efficacement des projets de recherche dans plusieurs centres.
Abstract
Un nombre croissant de laboratoires doivent collecter des données à partir de plusieurs cytomètres en flux, en particulier pour les projets de recherche réalisés dans plusieurs centres. Les défis liés à l’utilisation de deux cytomètres en flux dans différents laboratoires comprennent le manque de matériaux normalisés, les problèmes de compatibilité logicielle, les incohérences dans la configuration des instruments et l’utilisation de configurations différentes pour différents cytomètres en flux. Pour établir une expérience standardisée de cytométrie en flux afin d’assurer la cohérence et la comparabilité des résultats expérimentaux entre plusieurs centres, une méthode de normalisation rapide et réalisable a été établie pour transférer les paramètres entre différents cytomètres en flux.
Les méthodes développées dans cette étude ont permis le transfert de paramètres expérimentaux et de modèles d’analyse entre deux cytomètres en flux dans différents laboratoires pour la détection des lymphocytes chez les enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise (EJ). Une intensité de fluorescence constante a été obtenue entre les deux cytomètres en utilisant des billes standard de fluorescence pour établir les réglages du cytomètre. Des résultats comparables ont été obtenus dans deux laboratoires avec différents types d’instruments. En utilisant cette méthode, nous pouvons normaliser l’analyse pour évaluer la fonction immunitaire des enfants vaccinés par l’EJ dans différents laboratoires avec différents instruments, diminuer les différences de données et de résultats entre les cytomètres de flux dans plusieurs centres et fournir une approche réalisable pour l’accréditation mutuelle des résultats de laboratoire. La méthode de normalisation des expériences de cytomètre en flux assurera la performance efficace des projets de recherche dans plusieurs centres.
Introduction
La standardisation de la cytométrie en flux est utile pour la comparabilité des résultats obtenus à partir de différents cytomètres dans différents laboratoires et centres d’étude, et propice à la reconnaissance mutuelle des résultats pour améliorer l’efficacité du travail. Un nombre croissant de scénarios nécessitent une normalisation. Au cours du processus de développement du médicament, la normalisation de la cytométrie en flux est importante, car un test développé et validé soutiendra l’ensemble du processus de développement du médicament, de l’analyse préclinique à l’analyse clinique. Les méthodes de cytométrie en flux sont fréquemment transférées entre l’industrie pharmaceutique et les laboratoires collaborateurs1. De plus, il est essentiel d’obtenir des données comparables à partir d’études cliniques multicentriques. Par exemple, un flux de travail de normalisation a été développé dans le cadre du projet de recherche clinique multicentrique sur les maladies auto-immunes systémiques afin d’obtenir des données comparables à partir de la cytométrie en flux multicentrique2.
La normalisation des méthodes de cytométrie en flux est difficile. Les défis rencontrés dans les laboratoires sont attribués au manque de matériaux normalisés, aux problèmes de compatibilité logicielle, aux incohérences dans la configuration des instruments et à l’utilisation de configurations différentes entre différents cytomètres de flux et à des stratégies de contrôle divergentes entre les centres 3,4. Par conséquent, il est important d’effectuer une analyse des écarts entre les laboratoires. L’accès aux échantillons, les systèmes qualité, les qualifications du personnel et la configuration des instruments doivent être examinés pour s’assurer que les exigences sont respectées.
À l’heure actuelle, les enfants vaccinés avec le vaccin contre l’encéphalite japonaise (EJ) ont une incidence significativement réduite de JE5. La surveillance des cellules immunitaires du sang périphérique peut aider à comprendre les changements dans l’immunité adaptative à médiation cellulaire après la vaccination, et la corrélation entre les changements dans les sous-ensembles de lymphocytes du sang périphérique et les effets de la vaccination. En raison de la stabilité limitée des échantillons de sang total, les évaluations de l’efficacité du vaccin sont souvent effectuées dans plusieurs centres. Pour cette analyse, nous avons défini les lymphocytes T CD8+ ou CD4+ naïfs comme CD27+ CD45RA+, les lymphocytes T à mémoire centrale (T CM) comme CD27+ CD45RA-, les lymphocytes T à mémoire effectrice (T EM) comme CD27- CD45RA-, et les lymphocytes T à mémoire effectrice différenciée terminale (TEMRA) comme CD27– CD45RA+. Les lymphocytes B CD19+ peuvent être séparés en populations qui expriment CD27 par rapport aux IgD 6,7, les lymphocytes B naïfs expriment CD27n mémoire Les lymphocytes B (mBC) peuvent être identifiés en fonction de l’expression des IgD6, et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) peuvent être identifiés comme CD4+CD25++CD127faible 8. Pour établir une expérience standardisée de cytométrie en flux afin d’assurer la cohérence et la comparabilité des résultats expérimentaux dans plusieurs centres, une méthode de normalisation rapide et réalisable a été établie pour faciliter le transfert de protocoles entre différents cytomètres en flux pour la détection des lymphocytes dans le sang total des enfants vaccinés contre l’EJ. Six enfants en bonne santé (2 ans) ont été recrutés à l’hôpital pour enfants de Beijing de l’Université médicale de la capitale. Après avoir reçu une vaccination prime et boost avec un vaccin vivant atténué contre l’encéphalite japonaise SA14-14-2 moins de 6 mois auparavant, des échantillons de sang périphérique ont été prélevés chez les volontaires. Des données très comparables ont été obtenues à partir de différents instruments suivant des procédures normalisées, ce qui est utile pour les évaluations multicentriques.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’immunophénotypage de sous-ensembles de lymphocytes du sang périphérique peut aider à comprendre les changements dans l’immunité adaptative à médiation cellulaire après la vaccination chez les enfants. Dans les applications cliniques, des situations inattendues se produisent, telles que l’incapacité de détecter les échantillons en temps opportun ou le remplacement d’un cytomètre en flux; Par conséquent, des méthodes normalisées rapides qui facilitent les transferts entre cytomètres en flux dans<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RW a été soutenu par Beijing Natural Science Foundation, Chine (n ° 7222059), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 82002130), XZ a été soutenu par le Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (n ° 2019-I2M-5-026).
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
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