סטנדרטיזציה של העברה בין מעבדות בין ציטומטרים של זרימה לאיתור לימפוציטים בדלקת המוח היפנית ילדים מחוסנים
Summary
במחקר זה פותחה שיטה המאפשרת העברה של הגדרות ניסוי ותבניות ניתוח בין שני ציטומטרים של זרימה בשתי מעבדות לאיתור לימפוציטים בילדים מחוסנים לדלקת המוח היפנית. שיטת התקינה לניסויי ציטומטר הזרימה תאפשר לבצע פרויקטים מחקריים ביעילות במספר מרכזים.
Abstract
מספר גדל והולך של מעבדות צריכות לאסוף נתונים מציטומטרים מרובים של זרימה, במיוחד עבור פרויקטי מחקר המבוצעים על פני מרכזים מרובים. האתגרים בשימוש בשני ציטומטרים של זרימה במעבדות שונות כוללים היעדר חומרים סטנדרטיים, בעיות תאימות תוכנה, חוסר עקביות בהגדרת המכשירים ושימוש בתצורות שונות עבור ציטומטרים שונים של זרימה. כדי לבסס ניסוי ציטומטריית זרימה מתוקננת להשגת עקביות ויכולת השוואה של תוצאות ניסוי על פני מרכזים מרובים, הוקמה שיטת סטנדרטיזציה מהירה וישימה להעברת פרמטרים על פני ציטומטרים שונים של זרימה.
השיטות שפותחו במחקר זה אפשרו העברה של הגדרות ניסוי ותבניות ניתוח בין שני ציטומטרים של זרימה במעבדות שונות לאיתור לימפוציטים בילדים מחוסנים בדלקת המוח היפנית (JE). עוצמת פלואורסצנטיות עקבית התקבלה בין שני הציטומטרים באמצעות חרוזים סטנדרטיים פלואורסצנטיים כדי לקבוע את הגדרות הציטומטר. תוצאות דומות התקבלו בשתי מעבדות עם סוגים שונים של מכשירים. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים לתקנן ניתוח להערכת תפקוד החיסון של ילדים שחוסנו ב- JE במעבדות שונות עם מכשירים שונים, להפחית את ההבדלים בנתונים ובתוצאות בין ציטוטמדי זרימה במספר מרכזים, ולספק גישה ישימה להסמכה הדדית של תוצאות מעבדה. שיטת הסטנדרטיזציה של ניסויי ציטומטר זרימה תבטיח ביצוע יעיל של פרויקטי מחקר על פני מרכזים מרובים.
Introduction
הסטנדרטיזציה של ציטומטריית זרימה שימושית להשוואת תוצאות המתקבלות מציטומטרים שונים במעבדות ומרכזי מחקר שונים, ותורמת להכרה הדדית בתוצאות לשיפור יעילות העבודה. מספר גדל והולך של תרחישים דורשים סטנדרטיזציה. במהלך תהליך פיתוח התרופה, סטנדרטיזציה של ציטומטריית זרימה חשובה, שכן בדיקה מפותחת ומתוקפת תתמוך בכל תהליך פיתוח התרופה מניתוח פרה-קליני ועד לניתוח קליני. שיטות ציטומטריות זרימה מועברות לעתים קרובות בין תעשיית התרופות לבין מעבדות משתפות פעולה1. יתר על כן, חיוני לקבל נתונים דומים ממחקרים קליניים רב-מרכזיים. לדוגמה, זרימת עבודה של סטנדרטיזציה פותחה בפרויקט המחקר הקליני הרב-מרכזי למחלות אוטואימוניות מערכתיות כדי לקבל נתונים דומים מציטומטריית זרימה רב-צנטרית2.
הסטנדרטיזציה של שיטות ציטומטריית זרימה היא מאתגרת. האתגרים שנחווים במעבדות שונות מיוחסים למחסור בחומרים סטנדרטיים, בעיות תאימות תוכנה, חוסר עקביות בהתקנת מכשירים, ושימוש בתצורות שונות בין ציטומטרים שונים של זרימה ואסטרטגיות gating שונות בין המרכזים 3,4. לכן, חשוב לבצע ניתוח פער בין מעבדות. יש לבדוק גישה לדוגמה, מערכות איכות, כישורי כוח אדם ותצורת מכשירים כדי להבטיח עמידה בדרישות.
כיום, לילדים שחוסנו בחיסון נגד דלקת המוח היפנית (JE) יש שכיחות מופחתת משמעותית של JE5. ניטור תאי מערכת החיסון ההיקפיים בדם יכול לסייע בהבנת השינויים בחסינות הנרכשת בתיווך התא לאחר החיסון, ובקורלציה בין השינויים בתת-קבוצות לימפוציטים היקפיים בדם לבין השפעות החיסון. בשל היציבות המוגבלת של דגימות דם שלמות, הערכות של יעילות החיסון מבוצעות לעתים קרובות במספר מרכזים. לצורך ניתוח זה, הגדרנו תאי T נאיביים CD8+ או CD4+ כ- CD27+ CD45RA+, תאי T של זיכרון מרכזי (TCM) כ- CD27+ CD45RA-, תאי T של זיכרון אפקט (TEM) כ- CD27- CD45RA-, ותאי T של זיכרון אפקטור ממוין סופי (TEMRA) כ- CD27– CD45RA+. ניתן להפריד תאי CD19+ B לאוכלוסיות המבטאות CD27 לעומת IgD 6,7, תאי B נאיביים מבטאים CD27n תאי זיכרון B (mBCs) ניתנים לזיהוי על סמך ביטוי IgD6, ותאי T רגולטוריים (Tregs) ניתנים לזיהוי כ- CD4+CD25++CD127 נמוך 8. כדי לבסס ניסוי ציטומטריית זרימה מתוקננת להשגת עקביות ויכולת השוואה של תוצאות ניסוי במספר מרכזים, הוקמה שיטת סטנדרטיזציה מהירה וישימה כדי להקל על העברת פרוטוקולים על פני ציטומטרים שונים של זרימה לאיתור לימפוציטים בכל הדם של ילדים שחוסנו ב- JE. שישה ילדים בריאים (בני שנתיים) גויסו מבית החולים לילדים בבייג’ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. לאחר קבלת חיסון ראשוני וזריקת דחף בחיסון חי מוחלש JE SA14-14-2 פחות מ-6 חודשים קודם לכן, נאספו דגימות דם היקפיות מהמתנדבים. נתונים דומים מאוד התקבלו ממכשירים שונים בעקבות נהלים סטנדרטיים, אשר מועילים להערכות רב-מרכזיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אימונופנוטיפ של תת-קבוצות לימפוציטים היקפיים בדם יכול לעזור להבין את השינויים בחסינות הנרכשת התאית-תיווכת לאחר החיסון בילדים. ביישומים קליניים, מתרחשים מצבים בלתי צפויים, כגון כשל בזיהוי דגימות בזמן או החלפת ציטומטר זרימה; לכן, יש צורך בשיטות סטנדרטיות מהירות המאפשרות מעבר בין ציטומטרים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RW נתמך על ידי קרן מדעי הטבע של בייג’ינג, סין (מס ‘7222059), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘82002130), XZ נתמך על ידי קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (מס ‘2019-I2M-5-026).
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
