Summary

Standardisierung des Transfers zwischen Laboren zwischen Durchflusszytometern zum Nachweis von Lymphozyten bei mit japanischer Enzephalitis geimpften Kindern

Published: February 10, 2023
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Summary

In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um den Transfer von Versuchssettings und Analyseschablonen zwischen zwei Durchflusszytometern in zwei Laboratorien zum Nachweis von Lymphozyten bei mit Japanischer Enzephalitis geimpften Kindern zu erleichtern. Die Standardisierungsmethode für die Durchflusszytometer-Experimente wird es ermöglichen, Forschungsprojekte in mehreren Zentren effektiv durchzuführen.

Abstract

Immer mehr Labore müssen Daten von mehreren Durchflusszytometern sammeln, insbesondere für Forschungsprojekte, die in mehreren Zentren durchgeführt werden. Zu den Herausforderungen bei der Verwendung von zwei Durchflusszytometern in verschiedenen Labors gehören das Fehlen standardisierter Materialien, Software-Kompatibilitätsprobleme, Inkonsistenzen bei der Geräteeinrichtung und die Verwendung unterschiedlicher Konfigurationen für verschiedene Durchflusszytometer. Um ein standardisiertes Durchflusszytometrie-Experiment zu etablieren, um die Konsistenz und Vergleichbarkeit der experimentellen Ergebnisse über mehrere Zentren hinweg zu erreichen, wurde eine schnelle und praktikable Standardisierungsmethode etabliert, um Parameter über verschiedene Durchflusszytometer hinweg zu übertragen.

Die in dieser Studie entwickelten Methoden ermöglichten den Transfer von Versuchssettings und Analyseschablonen zwischen zwei Durchflusszytometern in verschiedenen Laboratorien zum Nachweis von Lymphozyten bei Kindern, die mit Japanischer Enzephalitis (JE) geimpft wurden. Eine konsistente Fluoreszenzintensität wurde zwischen den beiden Zytometern unter Verwendung von Fluoreszenz-Standardkügelchen erhalten, um die Zytometereinstellungen festzulegen. Vergleichbare Ergebnisse wurden in zwei Laboratorien mit unterschiedlichen Instrumententypen erzielt. Mit dieser Methode können wir die Analyse zur Bewertung der Immunfunktion von JE-geimpften Kindern in verschiedenen Labors mit unterschiedlichen Instrumenten standardisieren, die Unterschiede in den Daten und Ergebnissen zwischen Durchflusszytometern in mehreren Zentren verringern und einen praktikablen Ansatz für die gegenseitige Akkreditierung von Laborergebnissen bieten. Die Standardisierungsmethode von Durchflusszytometer-Experimenten wird die effektive Durchführung von Forschungsprojekten über mehrere Zentren hinweg sicherstellen.

Introduction

Die Standardisierung der Durchflusszytometrie ist nützlich für die Vergleichbarkeit von Ergebnissen, die von verschiedenen Zytometern in verschiedenen Labors und Studienzentren erhalten wurden, und fördert die gegenseitige Anerkennung von Ergebnissen, um die Arbeitseffizienz zu verbessern. Immer mehr Szenarien erfordern eine Standardisierung. Während des Arzneimittelentwicklungsprozesses ist die Standardisierung der Durchflusszytometrie wichtig, da ein entwickelter und validierter Assay den gesamten Arzneimittelentwicklungsprozess von der präklinischen bis zur klinischen Analyse unterstützt. Durchflusszytometrische Methoden werden häufig zwischen der pharmazeutischen Industrie und kooperierenden Laboratorien transferiert1. Darüber hinaus ist es wichtig, vergleichbare Daten aus multizentrischen klinischen Studien zu erhalten. So wurde beispielsweise im Rahmen des Multizentrischen Klinischen Forschungsprojekts Systemische Autoimmunerkrankungen ein Standardisierungs-Workflow entwickelt, um vergleichbare Daten aus der multizentrischen Durchflusszytometrie2 zu erhalten.

Die Standardisierung von Durchflusszytometrie-Methoden ist eine Herausforderung. Die Herausforderungen, mit denen die Labore konfrontiert sind, werden auf das Fehlen standardisierter Materialien, Software-Kompatibilitätsprobleme, Inkonsistenzen bei der Geräteeinrichtung und die Verwendung unterschiedlicher Konfigurationen zwischen verschiedenen Durchflusszytometern und divergierenden Gating-Strategien zwischen den Zentren zurückgeführt 3,4. Daher ist es wichtig, eine Lückenanalyse zwischen den Laboren durchzuführen. Der Probenzugang, die Qualitätssysteme, die Qualifikation des Personals und die Gerätekonfiguration müssen überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Anforderungen erfüllt werden.

Gegenwärtig haben Kinder, die mit dem Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis (JE) geimpft wurden, eine signifikant reduzierte Inzidenz von JE5. Die Überwachung peripherer Blutimmunzellen kann helfen, die Veränderungen der zellvermittelten adaptiven Immunität nach der Impfung und die Korrelation zwischen den Veränderungen in peripheren Blutlymphozyten-Untergruppen und den Auswirkungen der Impfung zu verstehen. Aufgrund der begrenzten Stabilität von Vollblutproben werden die Evaluierungen der Wirksamkeit des Impfstoffs häufig in mehreren Zentren durchgeführt. Für diese Analyse definierten wir naive CD8+- oder CD4+-T-Zellen als CD27+ CD45RA+, zentrale Gedächtnis-T-Zellen (TCM) als CD27+ CD45RA-, Effektor-Gedächtnis-T-Zellen (TEM) als CD27-CD45RA- und terminal-differenzierte Effektorgedächtnis-T-Zellen (TEMRA) als CD27-CD45RA+. CD19+ B-Zellen können in Populationen unterteilt werden, die CD27 gegenüber IgD 6,7 exprimieren, naive B-Zellen exprimieren CD27n-Gedächtnis-B-Zellen (mBCs) können basierend auf der Expression von IgD6 identifiziert werden, und regulatorische T-Zellen (Tregs) können als CD4+CD25++CD127niedrig 8 identifiziert werden. Um ein standardisiertes Durchflusszytometrie-Experiment zu etablieren, um die Konsistenz und Vergleichbarkeit der experimentellen Ergebnisse in mehreren Zentren zu erreichen, wurde eine schnelle und praktikable Standardisierungsmethode etabliert, um die Übertragung von Protokollen zwischen verschiedenen Durchflusszytometern für den Nachweis von Lymphozyten im Vollblut von JE-geimpften Kindern zu erleichtern. Sechs gesunde Kinder (2 Jahre alt) wurden aus dem Beijing Children’s Hospital der Capital Medical University rekrutiert. Nach einer Grund- und Auffrischungsimpfung mit einem attenuierten JE SA14-14-2-Lebendimpfstoff vor weniger als 6 Monaten wurden periphere Blutproben von den Freiwilligen entnommen. Es wurden hochgradig vergleichbare Daten von verschiedenen Instrumenten nach standardisierten Verfahren gewonnen, was für multizentrische Assessments hilfreich ist.

Protocol

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, genehmigt (Zulassungsnummer: 2020-k-85). Auf die Einverständniserklärung der Probanden wurde verzichtet, da in dieser Studie nur Restproben nach klinischen Tests verwendet wurden. An dieser Studie sind zwei Labore beteiligt. Im Transferlabor wurde die standardisierte Methode mit einem Durchflusszytometer entwickelt. Das Zytometer in diesem Labor wird im Folgenden als Zytometer A bezeic…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt ein globales Arbeitsblatt der Zielwertvorlage für die hellen CST-Perlen. Unter Verwendung eines FSC/SSC-Diagramms wird ein Polygon-Gate gezeichnet, um die hellen CST-Perlen auszuwählen. Histogrammdiagramme von 10 Fluoreszenzkanälen wurden für die hellen CST-Beads erhalten: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 und BV605. Der Zielwert für jeden Parameter wird angezeigt, indem der Median innerhalb der Histogrammgatter in Tabelle 2 angez…

Discussion

Die Immunphänotypisierung von Untergruppen peripherer Blutlymphozyten kann helfen, die Veränderungen der zellvermittelten adaptiven Immunität nach der Impfung bei Kindern zu verstehen. In klinischen Anwendungen treten unerwartete Situationen auf, wie z. B. das Versäumnis, Proben rechtzeitig zu erkennen, oder der Austausch eines Durchflusszytometers; Daher sind schnell standardisierte Methoden erforderlich, die den Transfer zwischen Durchflusszytometern in verschiedenen Labors erleichtern<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

RW wurde unterstützt von der Beijing Natural Science Foundation, China (Nr. 7222059), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82002130), XZ wurde vom CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (Nr. 2019-I2M-5-026) unterstützt.

Materials

BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD 552843 compensation
BD FACSCanto BD FACSCanto flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads BD 655051 define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 BD 562436 Fluorescent antibody 
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 BD 562656 Fluorescent antibody 
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 BD 560777 Fluorescent antibody 
BD LSRFortessa BD LSRFortessa flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 BD 745907 Fluorescent antibody 
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 BD 751953 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA BD 550855 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 BD 560176 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 BD 566320 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 BD 555432 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD BD 561314 Fluorescent antibody 
Brilliant Staining Buffer Plus BD 566385 Staining Buffer
Centrifuge Eppendorf 5810 Cell centrifugation
Centrifuge Tube BD Falcon BD-35209715 15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads BD 662414 standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate BD 349202 lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS) Gibco 10010-023 PBS
Round-bottom test tube BD Falcon 352235 5 mL test tube

References

  1. Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
  2. Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
  3. Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
  4. Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
  5. Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
  6. Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
  7. Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
  8. Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
  9. Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
  10. Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
  11. Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).

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Cite This Article
Ge, H., Zhang, L., Liu, M., Yang, X., Wu, X., Wang, R., Xie, Z. Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children. J. Vis. Exp. (192), e64949, doi:10.3791/64949 (2023).

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