流式细胞仪之间实验室转移的标准化，用于检测接种日本脑炎疫苗的儿童淋巴细胞
Summary
在这项研究中，开发了一种方法来促进两个实验室中两个流式细胞仪之间实验设置和分析模板的转移，以检测接种日本脑炎疫苗的儿童的淋巴细胞。流式细胞仪实验的标准化方法将使研究项目能够在多个中心有效进行。
Abstract
越来越多的实验室需要从多个流式细胞仪收集数据，特别是对于跨多个中心进行的研究项目。在不同实验室使用两台流式细胞仪的挑战包括缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致以及不同流式细胞仪使用不同的配置。为了建立标准化的流式细胞术实验，实现实验结果在多个中心的一致性和可比性，建立了一种快速可行的标准化方法，在不同流式细胞仪之间传递参数。
本研究中开发的方法允许在不同实验室的两个流式细胞仪之间转移实验设置和分析模板，以检测接种乙型脑炎（JE）的儿童的淋巴细胞。使用荧光标准微球在两个细胞仪之间获得一致的荧光强度，以建立细胞仪设置。在两个使用不同类型仪器的实验室中获得了可比的结果。利用该方法，我们可以对不同实验室使用不同仪器评估JE接种儿童免疫功能的分析进行标准化，减少多个中心流式细胞仪之间数据和结果的差异，为实验室结果的相互认证提供可行的方法。流式细胞仪实验的标准化方法将确保跨多个中心的研究项目的有效性能。
Introduction
流式细胞术的标准化有助于不同实验室和研究中心不同细胞仪结果的可比性，有利于结果的相互认可，提高工作效率。越来越多的方案需要标准化。在药物开发过程中，流式细胞术标准化非常重要，因为开发和验证的检测方法将支持从临床前到临床分析的整个药物开发过程。流式细胞术方法经常在制药行业和合作实验室之间转移1.此外，从多中心临床研究中获取可比数据至关重要。例如，在系统性自身免疫性疾病多中心临床研究项目中开发了一个标准化工作流程，以获得多中心流式细胞术2的可比数据。
流式细胞术方法的标准化具有挑战性。实验室面临的挑战归因于缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致以及不同流式细胞仪之间使用不同的配置以及中心之间的不同门控策略3，4。因此，在实验室之间进行差距分析很重要。必须审查样品访问、质量体系、人员资格和仪器配置，以确保满足要求。
目前，接种乙型脑炎（JE）疫苗的儿童乙型乙型肝炎5发病率显著降低。监测外周血免疫细胞有助于了解接种后细胞介导的适应性免疫的变化，以及外周血淋巴细胞亚群的变化与疫苗接种效果之间的相关性。由于全血样本的稳定性有限，疫苗功效的评估通常在多个中心进行。对于此分析，我们将幼稚CD8+或CD4 + T细胞定义为CD27 + CD45RA+，将中枢记忆T细胞（TCM）定义为CD27 + CD45RA-，效应记忆T细胞（TEM）定义为CD27-CD45RA-，终末分化的效应记忆T细胞（T EMRA）定义为CD27-CD45RA+。CD19+ B细胞可以分为表达CD27与IgD 6，7的群体，表达CD27n记忆的幼稚B细胞可以根据IgD 6的表达进行鉴定，调节性T细胞（Tregs）可以鉴定为CD4 + CD25++ CD127低8。为了建立标准化的流式细胞术实验，以实现多个中心实验结果的一致性和可比性，建立了一种快速可行的标准化方法，以促进不同流式细胞仪之间转移方案，以检测接种乙脑疫苗的儿童全血淋巴细胞。从首都医科大学附属北京儿童医院招募了6名健康儿童（2岁）。在不到6个月前接种了JE SA14-14-2减毒活疫苗后，从志愿者身上收集了外周血样本。按照标准化程序从不同仪器获得高度可比的数据，这有助于多中心评估。
Protocol
Representative Results
Discussion
外周血淋巴细胞亚群的免疫分型有助于了解儿童接种疫苗后细胞介导的适应性免疫的变化。在临床应用中，会出现意外情况，如未能及时检测样本或更换流式细胞仪;因此，需要快速标准化的方法，以促进不同实验室中流式细胞仪之间的转移9，10，11。在这里，我们描述了一种快速标准化的方法，以确保不同仪器之间的结果一致…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RW获得北京自然科学基金（第7222059号），国家自然科学基金（第82002130号），XZ获得中国医学科学院医学科学创新基金（编号：2019-I2M-5-026）的支持。
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
