ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृतियां विवो स्टेम सेल आला का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रदान करती हैं। यहां, एसोफेजेल ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृतियों के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इसके अतिरिक्त, फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनॉइड इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए पूरे माउंट इमेजिंग का उपयोग किया जाता है।
उपकला स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं जीवन भर उपकला बाधा के गठन और रखरखाव में योगदान करती हैं। अधिकांश स्टेम और पूर्वज कोशिका आबादी शारीरिक रूप से अलग-अलग स्थानों में छिपी हुई है, जो स्टेमनेस को बनाए रखने वाले आला संकेतों के साथ विशेष बातचीत को सक्षम करती है। जबकि उपकला ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों का विकास होमियोस्टैसिस और बीमारी में स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं की भूमिका को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, आला वातावरण के भीतर बातचीत काफी हद तक अनुपस्थित है, जिससे स्टेम सेल व्यवहार को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान में बाधा उत्पन्न होती है। फाइब्रोब्लास्ट उपकला स्टेम और पूर्वज भाग्य को निर्देशित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां, एसोफेजेल पूर्वज कोशिका नवीकरण और भेदभाव में फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी के चित्रण को सक्षम करने वाला एक व्यापक ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृति प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, अन्नप्रणाली से समानांतर में उपकला कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट दोनों को अलग करने की एक विधि का वर्णन किया गया है। एसोफैगल पूर्वज कोशिकाओं के साथ-साथ ट्रांसजेनिक रिपोर्टर या जंगली प्रकार के चूहों से फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी दोनों को अलग करने के लिए अलग-अलग प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग रणनीतियों को रेखांकित किया गया है। यह प्रोटोकॉल एक बहुमुखी दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसे विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी के अलगाव को समायोजित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एसोफेजेल एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड मोनो-कल्चर की स्थापना और पासिंग इस प्रोटोकॉल में शामिल है, जो सह-संस्कृति प्रणाली के साथ सीधी तुलना को सक्षम करता है। इसके अलावा, उपकला-फाइब्रोब्लास्ट इंटरैक्शन के विस्तृत छवि विश्लेषण की अनुमति देने वाला एक 3 डी समाशोधन दृष्टिकोण वर्णित है। सामूहिक रूप से, यह प्रोटोकॉल विट्रो में एसोफेजेल स्टेम सेल आला घटकों की पहचान और समझने के लिए एक तुलनात्मक और अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करता है।
ऑर्गेनोइड्स का उपयोग स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए 3 डी इन विट्रो परख के रूप में किया जाता है, साथ ही स्टेम सेल आला 1,2,3,4 के सेलुलर घटकों से प्राप्त सिग्नलिंग संकेतों को समझने के लिए। माउस एसोफैगल ऑर्गेनोइड्स को पहली बार 2014 में वर्णित किया गया था और कई पत्रों ने विकास कारकों की पहचान की है, जैसे आर-स्पोंडिन (आरएसपीओ), एनओजीजीआईएन, और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), जो एसोफेजेल ऑर्गेनोइड्स 5,6,7 को बनाए रखने और पारित करने के लिए आवश्यक हैं, यह तर्क देते हुए कि विवो में इसी तरह के सिग्नलिंग संकेतों की आवश्यकता होती है। पूर्वज कोशिका नवीकरण। हालांकि, विकास कारकों को आमतौर पर गैर-शारीरिक सांद्रता में जोड़ा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनोइड विकास की स्थिति होती है जो आवश्यक रूप से विवो सिग्नलिंग वातावरण को प्रतिबिंबित नहीं करती है।
फाइब्रोब्लास्ट विषम स्ट्रोमल सेल आबादी हैं जो कई स्टेम सेल आलामें पूर्वज सेल गुणों का समर्थन करते हैं। एक ही ऑर्गेनॉइड संस्कृति में उपकला पूर्वज कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट का संयोजन बहिर्जात पूरक विकास कारकों की कम सांद्रता में ऑर्गेनोइड गठन को सक्षम बनाता है। आंतों और यकृत एपिथेलिया से ऑर्गेनोइड सह-संस्कृति प्रणालियों का वर्णन किया गया है, लेकिन एसोफेजेल ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल अभी भीउत्कृष्ट 9,10,11 है।
इस प्रोटोकॉल में, एसोफैगस से फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए दो फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) रणनीतियों को रेखांकित किया गया है, जिसमें ट्रांसजेनिकपीडीजीएफआर एच 2 बीईजीएफपी चूहों12 या शास्त्रीय एंटीबॉडी धुंधला होने वाले जंगली प्रकार के चूहों का उपयोग किया जाता है। फाइब्रोब्लास्ट्स की विभिन्न उप-आबादी को पसंद के सेल सतह मार्करों का उपयोग करके अलग किया जा सकता है, जिससे प्रोटोकॉल को लचीलापन मिलता है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान को संरक्षित करने वाली 3 डी फ्लोरेसेंस इमेजिंग तकनीक का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनोइड इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। ऑर्गेनोइड क्लियरिंग ऑर्गेनोइड्स में प्रकाश प्रवेश गहराई को बढ़ाने के लिए एक त्वरित विधि प्रदान करता है, ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट कनेक्शन के विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार करता है और ऑर्गेनोइड संरचना के पुन: समर्पण को इसकी संपूर्णता में सक्षम करता है। यह प्रोटोकॉल एक संपूर्ण माउंट इमेजिंग रणनीति के साथ एसोफैगल ऑर्गेनॉइड सह-संस्कृति को जोड़ता है, जिससे फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनॉइड इंटरैक्शन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन को सक्षम किया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल कार्यात्मक एसोफेजेल एपिथेलियल-फाइब्रोब्लास्ट इंटरैक्शन की जांच के लिए एक इन विट्रो मॉडल स्थापित करता है।
उपकला परत को स्ट्रोमा से अलग किया जाता है, जिससे उपकला और स्ट्रोमल डिब्बे दोनों के लिए एक अनुकूलित पृथक्करण प्रोटोकॉल की अनुमति मिलती है। उपकला पृथक्करण प्रोटोकॉल के अनुकूलन के बावजूद, ऊतक झुरमुट स्पष्ट रहते हैं। हर 15 मिनट में जोर से ऊपर और नीचे पाइपिंग करने से झुरमुट की संख्या और आकार काफी हद तक कम हो जाता है। अन्य प्रोटोकॉल एपिथेलियल परत 5,6 को और अलग करने के लिए ट्रिप्सिन का उपयोग करते हैं। यहां, ट्रिप्सिन का उपयोग, या पृथक्करण समय को और बढ़ाना, अनुशंसित नहीं है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप उपकला कोशिका व्यवहार्यता और ऑर्गेनोइड बनाने की दक्षता में कमी आती है। एपिथेलियम के विपरीत, स्ट्रोमा आसानी से अलग हो जाता है, और पृथक्करण समाधान में 30 मिनट के परिणामस्वरूप ~ 90% फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता (चित्रा 1 ई) के साथ एकल-कोशिका निलंबन होता है। प्रोटोकॉल में उपकला-स्टोमल पृथक्करण चरण को छोड़कर पृथक्करण समय काफी बढ़ जाता है, जिसके परिणामस्वरूप फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता में कमी आती है और उपकला कोशिकाओं की कम उपज होती है। इसके अतिरिक्त, स्ट्रोमा से उपकला को अलग करना प्रत्येक आबादी की सेल संख्या निर्धारित करने और सह-संस्कृतियों की स्थापना करते समय विभिन्न माउस लाइनों से उपकला कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को मिलाने का अवसर प्रदान करता है।
ऑर्गेनोइड विकास पर फाइब्रोब्लास्ट फ़ंक्शन का अध्ययन स्टेम सेल जीव विज्ञान 9,10,11,15,16 में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है। स्थापित सह-संस्कृति मीडिया या तो डीएमईएम को 10% भ्रूण बछड़े के सीरम (एफसीएस) 9,15 के साथ पूरक किया जाता है या विकास कारक कम मध्यम10,16 होता है। इस प्रोटोकॉल में, विकास कारक कम माध्यम का उपयोग विवो स्टेम सेल आला में स्थितियों की नकल करने के लिए किया जाता है, जहां फाइब्रोब्लास्ट काफी हद तक क्विसेंट होते हैं। एफसीएस एक विकास कारक समृद्ध सीरम है जिसके परिणामस्वरूप सह-संस्कृतियों में फाइब्रोब्लास्ट ्स की सक्रियता और प्रसार होता है, संभवतः विवो अवस्था से अलग फाइब्रोब्लास्ट सेल अवस्था के अनुरूप होता है। एफसीएस को बाहर करके और विकास कारकों को कम करके, ताकि अकेले माध्यम (ईआरकम) ऑर्गेनोइड विकास का समर्थन नहीं करता है और फाइब्रोब्लास्ट प्रसार को उत्तेजित नहीं करता है, ऑर्गेनोइड विकास पर फाइब्रोब्लास्ट के प्रभाव को अलग करना संभव है। इस माध्यम में, NOGGIN को हटा दिया जाता है और RSPO को न्यूनतम (10% RPSO) तक घटा दिया जाता है। एनओजीजीआईएन और आरएसपीओ दोनों को एसोफेजेल ऑर्गेनॉइड विकास के लिए आवश्यक दिखाया गयाहै। ईजीएफ को सह-संस्कृति माध्यम में बनाए रखा गया था, क्योंकि यह अपने आप में ऑर्गेनोइड विकास का समर्थन नहीं करता है। हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट ्स ईजीएफ-कम माध्यम (ईकमआरकम) में ऑर्गेनोइड विकास का समर्थन करने में भी सक्षम हैं। चित्र 2 बी, डी)।
ऑर्गेनॉइड सह-संस्कृतियों को पासिंग के माध्यम से बनाए नहीं रखा जा सकता है क्योंकि ट्रिप्सिनाइजेशन के दौरान फाइब्रोब्लास्ट खो जाते हैं। हालांकि, ऑर्गेनॉइड पासिंग को प्रोटोकॉल में शामिल किया गया था क्योंकि एसोफैगल ऑर्गेनोइड्स को मोनो-संस्कृतियों के रूप में आगे के प्रयोग के लिए बनाए रखा, विस्तारित और उपयोग किया जा सकता है। मोनो-संस्कृतियों से पारित ऑर्गेनोइड्स का उपयोग ताजा पृथक फाइब्रोब्लास्ट के साथ सह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए किया जा सकता है। प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करने का एक नुकसान कई ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए आवश्यक चूहों की संख्या है। फाइब्रोब्लास्ट की छोटी उप-आबादी पर ध्यान केंद्रित करते समय, प्राप्त सह-संस्कृतियों की संख्या सीमित होती है। अन्य प्रोटोकॉल में, फाइब्रोब्लास्ट्स को पहले ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए उपयोग करने से पहले संस्कृति में विस्तारित किया जाताहै। हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट पासिंग के दौरान आकृति विज्ञान और पहचान को बदलते हैं, जो प्राथमिक त्वचा और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट17,18 का उपयोग करके दिखाया गया है। एसोफेजेल फाइब्रोब्लास्ट्स के पारंपरिक 2 डी पासिंग के परिणामस्वरूप आकृति विज्ञान और फेनोटाइप परिवर्तन दोनों होते हैं, यह दर्शाता है कि फाइब्रोब्लास्ट का इन विट्रो संवर्धन सह-संस्कृतियों के लिए उपयुक्त नहीं है जिसका उद्देश्य अंतर्जात स्टेम सेल आला की नकल करना है।
पूरे माउंट धुंधला फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनॉइड इंटरैक्शन को बनाए रखने और कल्पना करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, जबकि सभी ऑर्गेनोइड्स में फाइब्रोब्लास्ट ्स सीधे उनसे जुड़े नहीं होंगे, अधिकांश ऑर्गेनोइड फाइब्रोब्लास्ट के संपर्क में हैं ( चित्रा 2 सी देखें)। उपकला-फाइब्रोब्लास्ट इंटरैक्शन को बनाए रखने के लिए, ऑर्गेनोइड्स को देखभाल के साथ संभालना और जोरदार पिपेटिंग, भंवर और उच्च गति कताई से बचना महत्वपूर्ण है। इष्टतम निर्धारण 3 डी ऊतक वास्तुकला को बनाए रखने के साथ-साथ अंतर्जात प्रतिदीप्ति रखने के लिए महत्वपूर्ण है। एक 30 मिनट निर्धारण एच 2बीजीएफपी सिग्नल को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के लिए इष्टतम है, हालांकि यह फ्लोरोफोर और उपयोग किए गए एंटीबॉडी के बीच भिन्न हो सकता है। ऑर्गेनोइड्स को साफ़ करने से प्रकाश प्रकीर्णन कम हो जाता है और पूरे 3 डी संरचना के विज़ुअलाइज़ेशन में काफी सुधार होता है। चूंकि ऑर्गेनोइड छोटे होते हैं, इसलिए क्लियरिंग आसान और तेज होती है; हालांकि, लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग समय लेने वाली हो सकती है, क्योंकि कई जेड-स्टैक्स बनाने की आवश्यकता होती है। कंफोकल माइक्रोस्कोप, स्पिनिंग डिस्क की तरह, इमेजिंग समय को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
कुल मिलाकर, फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति में उगाए गए एसोफेजेल ऑर्गेनोइड एसोफेजेल स्टेम सेल आला के पहलुओं को समझने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करते हैं। इसके अलावा, पूरे माउंट क्लियरिंग फाइब्रोब्लास्ट और ऑर्गेनोइड्स के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए एक सुलभ विधि प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को ईआरसी एसटीजी ट्रॉयकैन (851241) द्वारा समर्थित किया गया था। ई.ई. एक कैंसरफोंडेन पोस्टडॉक्टरल एसोसिएट है। एमजी एक रैग्नार सोडरबर्ग फेलो और कैंसरफोंडेन जूनियर इन्वेस्टिगेटर हैं। हम बायोमेडिकम फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा, बायोमेडिकम इमेजिंग कोर (बीआईसी), और तुलनात्मक चिकित्सा बायोमेडिकम (केएमबी) पशु सुविधा सहित कारोलिंस्का इंस्टीट्यूट कोर सुविधाओं से तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। हम प्रोटोकॉल पर ध्यान से पढ़ने और टिप्पणी करने के लिए जेनेंडर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher (Gibco) | 17504001 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | fisher scientific | 356231 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11320074 | |
DPBS | Thermo Fisher (Gibco) | 14190250 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher (Gibco) | 35050061 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 14175-129 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher (Gibco) | 15140122 | |
Triton X-100 solution | Merck | 93443-100ML | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 25200-056 | |
Chemicals, Peptides, and recombinant proteins | |||
DAPI Solution | Thermo Fisher | 62248 | |
Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS | |||
Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol | Sigma-Aldrich | 252549-1L | |
Liberase | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
N-Acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Noggin murine | Peprotech | 250-38 | |
RapiClear 1.47 | SunJin Lab | #RC147001 | |
Recombinant Mouse EGF Protein, CF | R&D systems | 2028-EG-200 | |
R-spondin-1 murine | Peprotech | 315-32 | |
SYTOX Blue Dead Cell Stain | Thermo Fisher | S34857 | |
Thermolysin | Sigma-Aldrich | T7902-25MG | |
Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503-5MG | |
Plastic & Glassware | |||
Corning Sterile Cell Strainers 40um | VWR | 15360801 | |
Corning Sterile Cell Strainers 70um | VWR | 431751 | |
Menzel Deckgläser/ cover slips | Thermo Fisher | Q10143263NR15 | |
SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP | Sarstedt | 72.706 | |
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL | Thermo Fisher | 3446 | |
SuperFrost Slides | VWR | 631-9483 | |
Tools | |||
0.05 mm 4 circular well iSpacer | SunJin Lab | #IS204 | |
Dumont #5 forceps, biology tip | F.S.T | 11252-20 | |
ImmEdge Pen | VectorLaboratories | H-4000 | |
Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge | F.S.T | 15033-09 | |
Instruments | |||
Confocal microscope Stellaris 5 | Leica | ||
Dissection microscope ZEISS Stemi 305 | Zeiss | ||
FACS ARIA III | BD Biosciences | ||
Conjugated Antibodies for FACS | |||
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A |
123608 | 123608 | |
APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody | H194-112 | H194-112 | |
PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody | 147310 | 147310 | |
Antibodies for Immunofluorescence | |||
CD104 (ß-integrin 4) Clone: 346-11A |
BioLegend | 553745 | |
Cytokeratin 14 | Acris Antibodies (AbD Serotec) | BP5009 | |
Cytokeratin13 Clone: EPR3671 |
abcam | ab92551 | |
E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11 |
Cell Signaling Technology | 3195 | |
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059 |
BioLegend | 905901 | |
p63 Clone: 4a4 |
abcam | ab735 | |
Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25 |
abcam | ab214666 | |
Vimentin | Sigma-Aldrich | AB5733 | |
Secondary antibodies | |||
Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice | Jackson Immuno |