Caractérisation fonctionnelle et visualisation de fibroblastes œsophagiens à l’aide de co-cultures organoïdes

Les expériences sur les animaux pour cette étude ont été approuvées par Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (permis éthique n° 14051-2019). Les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d’agents pathogènes conformément aux recommandations de la Federation of European Laboratory Animal Science Association. 1. Préparation Décongeler les solutions mères enzymatiques utilisées pour la dissociation (voir le tableau des matériaux) sur la glace. Décongeler une partie aliquote de la matrice membranaire basale (matrice) réduite du facteur de croissance (DFG) à 4 °C. Préparer le milieu de culture. Utiliser le milieu décrit dans le tableau 1 pour les cultures organoïdes et les co-cultures et le préparer avant de commencer le protocole. 2. Dissection et séparation de l’épithélium œsophagien et du stroma REMARQUE : Assurez-vous que tous les instruments utilisés pour la dissection et le traitement des tissus sont stériles. Préparer 2 mL de solution de dissociation (voir le tableau des matières) dans la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) pour trois œsophages. Utilisez une souche de souris de votre choix, telle que les souris C57BL/6J. Le développement œsophagien chez la souris se termine après le jour postnatal (p) 70, il est donc recommandé d’utiliser des souris plus âgées que p7013. Utilisez quatre ou cinq souris car elles fournissent suffisamment de matériel pour établir 8 à 10 co-cultures organoïdes.REMARQUE: L’efficacité de formation des organoïdes diminue avec l’âge des souris. Si des sous-populations spécifiques de fibroblastes sont intéressantes, il est possible que le faible rendement en fibroblastes limite le nombre de co-cultures organoïdes qui peuvent être établies. Utiliser des souris génétiquement modifiées (p. ex. PdgfrαH2BeGFP) ou de type sauvage (WT) pour isoler les populations de fibroblastes. Lorsque vous utilisez des souris WT, effectuez une coloration des anticorps pour isoler des sous-populations de fibroblastes spécifiques du stroma via FACS. Euthanasier les souris par asphyxie au CO2 . Disséquer l’œsophage à l’aide d’une pince et de ciseaux à dissection. Pour enlever tout l’œsophage, coupez l’extrémité distale de l’œsophage directement au-dessus de l’estomac et l’extrémité proximale au début de la trachée. Immergez l’œsophage dans le PBS et mettez-le sur la glace. Retirer mécaniquement la musculeuse externe à l’aide d’un microscope à dissection (plage de grossissement total de 8x-40x) et d’une pince. Tenez l’extrémité distale de l’œsophage disséqué à l’aide d’une paire de forceps et utilisez l’autre forceps pour saisir et tirer le muscle de l’extrémité distale à l’extrémité proximale de l’œsophage disséqué. Retirez et jetez la couche musculaire. Ouvrez l’œsophage longitudinalement. Cela fonctionne mieux en utilisant des ciseaux à ressort de microdissection avec une pointe de bille pour prévenir les dommages aux tissus. Tenez une extrémité de l’œsophage afin d’insérer la boule des ciseaux à ressort dans la lumière de l’œsophage et coupez l’œsophage tout en tenant l’extrémité. Placez l’œsophage dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL ou une plaque de 24 puits. Incuber l’œsophage ouvert dans de la thermolysine à 0,5 mg/mL dans HBSS à 37 °C sur un agitateur à bascule pendant 15 min. Immergez complètement l’œsophage dans une solution de thermolysine.REMARQUE: Le volume de solution de thermolysine utilisé dépend de la taille du puits ou du tube. Plusieurs œsophages peuvent être placés et immergés dans le même puits ou tube. Retirez l’œsophage de la solution de thermolysine. Utilisez un microscope à dissection pour séparer soigneusement l’épithélium œsophagien du stroma. À l’aide de pinces fines, saisissez à la fois le côté épithélial et le côté stroma du tissu et séparez-les lentement pour séparer les deux couches.NOTE: Le stroma est identifié par son aspect blanc et opaque, contrairement à l’épithélium transparent. Le stroma contient la lamina propria et la couche sous-muqueuse. Transférer la couche épithéliale et stromale dans deux tubes microcentrifugeux distincts de 1,5 mL avec 200 μL de solution de dissociation dans HBSS. Mettez sur la glace. 3. Isolement des cellules progénitrices de l’œsophage REMARQUE: L’isolement des cellules progénitrices de l’œsophage (étape 2) et des fibroblastes (étape 3) peut être effectué simultanément. Préparer un tube de 50 ml de FBS à 1 % dans HBSS (1 % FBS). Transférer l’épithélium œsophagien séparé du tube microcentrifuge de 1,5 ml (étape 2.8) dans une boîte de Petri propre et utiliser un scalpel tranchant pour hacher. Prélever le tissu haché de la boîte de Petri avec 200 μL de solution de dissociation et le transférer dans le tube microcentrifuge de 1,5 mL.REMARQUE : L’épithélium est haché correctement lorsque les morceaux peuvent être replacés dans le tube microcentrifuge de 1,5 mL à l’aide d’un embout de pipette de 200 μL. Ajouter 800 μL de solution de dissociation fraîche au tube microcentrifuge de 1,5 mL jusqu’à un volume total de 1 mL.NOTE: Il est important d’ajouter un volume suffisant de solution de dissociation. Pour un à trois œsophages, 1 mL de solution est recommandé. Passez à l’échelle lorsque plusieurs œsophages sont traités à la fois. Placer le tube avec la couche épithéliale émincée sur un agitateur à bascule à 37 °C pendant 60 min. Pipeter la solution de haut en bas environ 20 fois à l’aide d’un embout de pipette de 200 μL toutes les 15 minutes pour améliorer la digestion. Après 60 min, montez et descendez encore 20 fois à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL. Passez la solution à travers une crépine cellulaire de 40 μm dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.REMARQUE: Mouillez la crépine cellulaire avec 1% FBS avant de filtrer les cellules pour minimiser l’adhérence des cellules au filtre. L’épithélium ne sera pas complètement digéré et des morceaux de tissu seront toujours visibles. Une incubation plus longue diminuera toutefois la survie des cellules et n’entraînera pas un rendement plus élevé de cellules viables. Jeter le surnageant en retirant l’excès de liquide à l’aide d’une pipette de 1 mL et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de FBS à 1 %. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.Pendant la centrifugation, préparer le mélange d’anticorps conjugués pour le FACS des cellules progénitrices de l’œsophage. Mélanger 1 μL de CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) et CD104-A647 (INTEGRIN-β4) dans 200 μL de FBS à 1 % par million de cellules.REMARQUE : 1 μL d’anticorps (volume final de 200 μL) est suffisant pour un ou deux œsophages. Lors du traitement de plusieurs œsophages à la fois, augmentez le volume de la solution de coloration d’anticorps. Remettez la pastille en suspension dans 200 μL de mélange d’anticorps et transférez-la dans un tube de cytométrie en flux. Après avoir ajouté des anticorps fluorescents, gardez les suspensions cellulaires dans l’obscurité pour éviter le blanchiment du signal. Incuber les cellules pendant 30 min à 4 °C. Ajouter 3 mL de FBS à 1 % et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C, puis remettre les cellules en suspension dans un minimum de 200 μL de FBS à 1 %.REMARQUE : On utilise 500 μL de FBS à 1 % pour un maximum de quatre ou cinq œsophages. Augmenter le volume lorsque plusieurs œsophages sont traités à la fois, de sorte qu’un débit FACS de 100-300 événements / s peut être atteint. Plus d’événements/s diminueront l’efficacité du tri, et une augmentation du débit diminuera la survie des cellules. Ajouter un marqueur de coloration de cellules mortes à une concentration finale de 1:10 000, 5 minutes avant le tri FACS pour isoler les cellules vivantes. Triez les cellules progénitrices à l’aide d’une machine FACS (voir la figure 1 pour la stratégie de contrôle). Recueillir les cellules dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL remplis de 200 μL de milieu organoïde basique (tableau 1). 4. Isolement des fibroblastes de la couche stromale Couper la couche stomale en petits morceaux dans un tube de 1,5 mL contenant 200 μL de solution de dissociation (étape 2.8) à l’aide de ciseaux à dissection. Le tissu est correctement haché une fois que la solution peut être pipetée de haut en bas à l’aide d’un embout de pipette de 200 μL. Ajouter 800 μL de solution de dissociation fraîche au tube microcentrifuge de 1,5 mL jusqu’à un volume total de 1 mL.NOTE: Il est important d’ajouter un volume suffisant de solution de dissociation. Pour un à trois œsophages, 1 mL de solution est recommandé. Passez à l’échelle lorsque plusieurs œsophages sont traités à la fois. Placer le tube sur un agitateur à bascule à 37 °C pendant 30 min. Après 15 minutes, pipeter la solution de haut en bas environ 20 fois à l’aide d’un embout de pipette de 200 μL pour améliorer la digestion. Après 30 minutes de digestion enzymatique, pipeter de haut en bas 20 fois à l’aide d’un embout de pipette de 200 μL. Filtrer la solution à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.REMARQUE: Mouillez la crépine cellulaire avec 1% FBS avant de filtrer les cellules pour minimiser l’adhérence des cellules au filtre. Jeter le surnageant en retirant l’excès de liquide à l’aide d’une pipette de 1 mL et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de FBS à 1 %. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.REMARQUE: Lors de l’utilisation d’une souche de souris génétiquement modifiée contenant des fibroblastes marqués par fluorescence, les colorations d’anticorps sont facultatives. Si aucune coloration d’anticorps n’est nécessaire, passez à l’étape 3.7 et transférez l’échantillon dans un tube de cytométrie en flux.Pendant la centrifugation, préparer le mélange d’anticorps conjugués pour l’isolement FACS des fibroblastes. Mélanger 1 μL de CD26-APC (DPP4) dans 200 μL de FBS à 1 % par million de cellules.REMARQUE : 1 μL d’anticorps est suffisant pour un ou deux œsophages. Lors du traitement de plusieurs œsophages à la fois, augmentez le volume de la solution de coloration d’anticorps. Resuspendre la pastille dans 200 μL de mélange d’anticorps conjugués dans du FBS à 1% et transférer dans un tube de cytométrie en flux. Incuber les cellules pendant 30 min à 4 °C. Ajouter 3 mL de FBS à 1 % et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettez les cellules en suspension dans un minimum de 200 μL de 1% de FBS.REMARQUE : On utilise 500 μL de FBS à 1 % pour un maximum de quatre ou cinq œsophages. Augmentez le volume lorsque plusieurs œsophages sont traités à la fois, de sorte qu’un débit de 100 à 300 événements/s peut être atteint. Plus d’événements/s diminueront l’efficacité du tri, et l’augmentation du débit diminuera la survie des cellules. Après l’ajout d’anticorps fluorescents, les suspensions cellulaires doivent être maintenues sombres pour éviter le blanchiment du signal. Ajouter un marqueur de coloration de cellules mortes à une concentration finale de 1:10 000, 5 minutes avant le tri FACS pour isoler les cellules vivantes. Triez les cellules à l’aide d’une machine FACS (voir la figure 1 pour la stratégie de contrôle). Recueillir les cellules dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL remplis de 200 μL de milieu organoïde basique (tableau 1). 5. Etablissement et culture des organoïdes œsophagiens NOTA : PréchaufferER bas (co-culture organoïde), milieu ENR (organoïde) (voir le tableau 1 pour la description) et une plaque de 48 puits à 37 °C. Placer la matrice décongelée (préparée à l’étape 1) sur de la glace. Il est recommandé d’utiliser la matrice fournie ici (voir le tableau des matériaux) pour la culture organoïde œsophagienne de souris, car d’autres marques de matrice affectent négativement l’efficacité de la formation organoïde. Pour la co-culture organoïde, mélanger les cellules épithéliales triées et les fibroblastes dans un rapport de 1:2 dans un tube. Pour chaque dôme matriciel, utilisez 5 000 cellules épithéliales et 10 000 fibroblastes. Lorsque vous vous préparez à plus de dômes, ajoutez un multiple de 5 000 cellules épithéliales et 10 000 fibroblastes dans un tube. Pour les cultures organoïdes sans fibroblastes, utilisez 5 000 cellules épithéliales par dôme matriciel. Centrifuger la population de cellules mixtes à 300 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant en le retirant délicatement à l’aide d’une pipette de 200 μL. Laver les cellules une fois en remettant la pastille en suspension dans un milieu organoïde basique froid et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Placez les cellules sur de la glace. Préparer un mélange composé de 80% de matrice et de 20% de milieu organoïde basique froid. Placez le tout sur la glace pendant que la matrice se solidifie à température ambiante (RT). Jeter le surnageant après centrifugation en le retirant délicatement à l’aide d’une pipette de 200 μL. Remettez les cellules en suspension dans 10 μL de mélange matriciel/dôme et remettez-les sur de la glace. Prenez la plaque préchauffée de 48 puits de l’incubateur à 37 °C et fabriquez un dôme matriciel par puits à l’aide d’une pipette de 20 μL. Chaque dôme contient 10 μL de matrice à 80%, 5 000 cellules épithéliales et 10 000 fibroblastes. Transférer la plaque à l’envers dans un incubateur et laisser les dômes se solidifier pendant encore 20-30 minutes à 37 ° C.REMARQUE: Une diminution du volume du dôme de la matrice et / ou une augmentation du nombre de cellules affectera l’efficacité de formation des organoïdes. Ajouter 200 μL de milieu ERfaible préchauffé (tableau 1) aux dômes matriciels contenant des co-cultures organoïdes et un milieu ENR (tableau 1) aux dômes matriciels respectifs contenant uniquement des organoïdes épithéliaux et placer la plaque dans l’incubateur. Cultiver les organoïdes à 37 °C et 5% de CO2. Pendant les 2 premiers jours, compléter le milieu avec un inhibiteur de roche de 10 μM (Y-27623). L’inhibiteur de roche empêche la mort cellulaire induite par le stress et augmente les chances d’une mise en place réussie de cultures organoïdes. Rafraîchir le milieu tous les 2-3 jours. Assurez-vous que le milieu est chaud pour éviter la dissociation de la matrice sensible à la température. Effectuer des analyses de l’expérience 6 à 8 jours après le placage. Les organoïdes peuvent être conservés en culture jusqu’à 14 jours. Vers le jour 14, une perte d’intégrité du dôme est observée. 6. Passage des organoïdes NOTE: La transmission d’organoïdes cultivés en co-culture entraîne la perte de fibroblastes. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser le milieu ENR pour tous les organoïdes lors du passage. Préchauffer ENR, PBS et une plaque de 48 puits à 37 °C. Retirer le milieu et laver le puits contenant le dôme de matrice avec du PBS préchauffé. Ajouter 200 μL de solution froide de trypsine à 0,25% et pipeter de haut en bas pour casser le dôme matriciel.REMARQUE: L’utilisation de trypsine froide à 0,25% est recommandée, car la matrice est sensible à la température, ce qui aide à décomposer les dômes de la matrice. Incuber les organoïdes avec de la trypsine à 37 °C pendant ~20 min. Pipeter de haut en bas après 10 min pour augmenter la dissociation des organoïdes. Surveillez le processus de dissociation avec un microscope toutes les 5-10 minutes. Puisque la trypsine diminue la viabilité cellulaire, cela peut aider à identifier le temps de dissociation idéal. Après 20 min, pipeter les organoïdes de haut en bas avec une pipette de 200 μL pour dissocier les organoïdes. Recueillir les cellules dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, ajouter 1 mL de milieu organoïde basique et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à TA. Facultatif : Pour garantir les meilleures conditions de croissance des organoïdes et que les nouveaux organoïdes sont dérivés de cellules individuelles, filtrer les cellules à l’aide d’une passoire cellulaire pré-mouillée de 40 μm. La filtration de la suspension cellulaire entraîne l’élimination des noyaux organoïdes et des amas cellulaires difficiles à dissocier. Préparer un mélange matriciel composé de 80 % de milieu organoïde basique à matrice et de 20 % de milieu organoïde basique froid. Placez le tout sur la glace, car la matrice se solidifie à RT. Jeter le surnageant en le retirant délicatement avec une pipette de 200 μL, remettre les cellules en suspension dans 10 μL de mélange matriciel/dôme et remettre le mélange sur de la glace.REMARQUE: Les organoïdes peuvent être divisés à un rapport de 1: 5 à 1: 10, en fonction de la densité du dôme. Les cellules épithéliales peuvent également être comptées et replaquées à 5 000 cellules / dôme. Prenez la plaque préchauffée de 48 puits de l’incubateur à 37 °C et faites un dôme par puits. Transférer la plaque à l’envers dans un incubateur et laisser les dômes se solidifier pendant encore 20-30 minutes à 37 ° C. Ajouter 200 μL de milieu ENR préchauffé aux dômes organoïdes respectifs. Compléter le milieu avec un inhibiteur de roche de 10 μM (Y-27623) pendant les 2 premiers jours. Rafraîchir le milieu tous les 2-3 jours. Assurez-vous que le milieu est chaud pour éviter la dissociation de la matrice sensible à la température. 7. Traitement organoïde pour la coloration de montage entier REMARQUE: Enduisez les embouts et les tubes de 10% FBS de PBS avant utilisation pour éviter que les organoïdes n’adhèrent aux plastiques. Pour les pointes de pipette, il suffit de pipeter une ou deux fois de haut en bas dans une solution FBS/PBS à 10% avant d’utiliser la pointe. Pour les tubes, remplissez le tube avec 10% FBS / PBS, puis retirez la solution. Retirez le milieu organoïde et ajoutez 200 μL de PBS glacé aux dômes de la matrice. Placez l’assiette sur de la glace pendant 5-10 min. Pipeter de haut en bas et transférer la solution dans des tubes non adhérents microcentrifuges de 0,6 mL. Centrifuger brièvement pendant 30-60 s à 100 x g pour laisser les organoïdes se déposer dans le fond.NOTE: Un pipetage excessif et une longue centrifugation cassent les organoïdes et perturbent l’interaction fibroblaste-organoïde. Retirez l’excès de liquide et ajoutez du PBS glacé. Centrifuger brièvement pendant 30-60 s à 100 x g pour laisser les organoïdes se déposer dans le fond. Retirer l’excès de liquide et fixer l’organoïde avec 200 μL de formaldéhyde froid à 4% dans une solution de PBS pendant 30 minutes sur glace.ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique et doit toujours être utilisé dans une hotte chimique. Des gants en nitrile, des lunettes de sécurité et des blouses de laboratoire doivent toujours être portés. La fixation de l’organoïde les fait couler et la centrifugation n’est plus nécessaire. Laissez les organoïdes couler en plaçant le tube à la verticale et attendez 2-3 minutes, retirez le formaldéhyde et ajoutez 500 μL de PBS froid pour éliminer le formaldéhyde. Laissez couler les organoïdes, retirez l’excès de PBS et ajoutez 500 μL de PBS frais froid. Laissez couler les organoïdes, retirez l’excès de PBS et ajoutez 500 μL de tampon bloquant (5% de sérum d’âne normal, 1% de BSA et 0,5% de Triton X-100 dans PBS). Mettez le tube sur un rocker-shaker pendant 60 min à RT.REMARQUE: Le blocage peut également être effectué pendant la nuit (O/N) à 4 °C. Laisser couler les organoïdes, retirer le tampon de blocage et remettre les organoïdes en suspension dans 200 μL de tampon bloquant avec des anticorps primaires (voir le tableau des matières). Maintenir les organoïdes sur un rocker-shaker O/N à 4 °C.NOTE: Pour améliorer la coloration des protéines nucléaires, des protéines faiblement exprimées ou des anticorps qui présentent une coloration non spécifique, le temps d’incubation peut être augmenté pendant 1 ou 2 jours à 4 ° C. Placer les organoïdes sur un agitateur à bascule est essentiel car cela empêche les organoïdes de s’agglutiner et augmente l’efficacité de la coloration. Laisser couler les organoïdes, retirer le mélange d’anticorps primaires et laver les organoïdes en utilisant 500 μL de Triton X-100 à 0,02% dans du PBS (0,02% Tx) pendant 60 minutes à TA. Répéter trois fois.REMARQUE: Lorsque l’incubation d’anticorps primaires est plus longue, ajouter une étape de lavage avec 0,02% Tx dans PBS O / N à 4 ° C. Laisser couler les organoïdes, retirer le tampon de lavage et ajouter 200 μL d’anticorps secondaire conjugué à la fluorescence dans le tampon de blocage O/N à 4 °C. Après avoir ajouté des anticorps secondaires fluorescents, gardez les organoïdes dans l’obscurité pour éviter le blanchiment du signal. Laisser couler les organoïdes, retirer le mélange d’anticorps secondaires et laver les organoïdes en utilisant 500 μL de Tx à 0,02% pendant 60 minutes à TA. Répéter trois fois. Contre-colorer les organoïdes avec 200 μL de solution DAPI (0,25 μg/mL) pour la coloration nucléaire si nécessaire. Incuber les échantillons pendant 60 min à TA sur un rocker-shaker. Laisser couler les organoïdes, retirer la solution DAPI et laver les organoïdes dans 500 μL de PBS pendant 15 min à TA. Répéter trois fois. Laissez les organoïdes couler et retirez tout excès de liquide. Ajouter 10 μL de solution de clairage aux organoïdes et incuber pendant 15 min à TA.REMARQUE: La solution de nettoyage est visqueuse, coupez donc la partie extérieure d’une pointe de pipette de 20 μL avant de pipeter la solution de nettoyage. Une solution de nettoyage supplémentaire peut être ajoutée si une entretoise plus grande est utilisée pour l’imagerie. La solution de montage peut être utilisée à la place de la solution de nettoyage lorsque les organoïdes ne sont pas nettoyés. La solution de nettoyage réduit l’arrière-plan lors de l’imagerie et augmente la profondeur d’imagerie. Placez une entretoise collante à 4 puits double face de 0,05 mm sur une lame de microscope. Ajouter les 10 μL de solution de nettoyage avec les organoïdes dans un puits et placer un couvercle sur le dessus de l’entretoise.REMARQUE: Les organoïdes peuvent également être montés sans l’utilisation d’une entretoise. L’entretoise maintient la forme organoïde intacte et empêche les organoïdes d’être aplatis. Gardez la lame à RT O/N pour effacer les organoïdes. Pour un stockage à long terme, maintenez les lames à 4 °C. Acquérir des images à l’aide d’un système de microscopie confocale.