Functional Characterization and Visualization of Espacageal Fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화)

이 연구를 위한 동물 실험은 스톡홀름 Norra djurförsöksetiska nämnd(윤리 허가 번호 14051-2019)의 승인을 받았습니다. 동물들은 유럽 실험 동물 과학 협회 연맹 (Federation of European Laboratory Animal Science Association)의 권고에 따라 병원체가없는 상태로 사육되었다. 1. 준비 해리에 사용되는 효소 원액( 재료 표 참조)을 얼음 위에서 해동합니다. 성장인자 환원(GFR) 기저막 매트릭스(matrix)의 분취량을 4°C에서 해동한다. 배양 배지를 준비합니다. 오가노이드 배양 및 공동 배양을 위해 표 1 에 기재된 배지를 사용하고 프로토콜을 시작하기 전에 준비합니다. 2. 식도 상피와 간질의 해부 및 분리 알림: 해부 및 조직 처리에 사용되는 모든 기구가 멸균되었는지 확인하십시오. 3 식도 당 Hanks의 균형 소금 용액 (HBSS)에서 2 mL의 해리 용액 ( 재료 표 참조)을 준비합니다. C57BL/6J 마우스와 같은 마우스 균주를 선택하십시오. 생쥐의 식도 발달은 출생 후 (p) 70 이후에 끝나므로 p7013보다 오래된 생쥐를 사용하는 것이 좋습니다. 4-5마리의 마우스는 8-10개의 오가노이드 공동 배양을 확립하기에 충분한 재료를 제공하므로 사용하십시오.참고: 오가노이드 형성 효율은 생쥐의 나이에 따라 감소합니다. 특정 섬유아세포 하위집단이 관심 대상인 경우, 낮은 섬유아세포 수율이 확립될 수 있는 오가노이드 공동배양의 수를 제한할 수 있다. 섬유아세포 집단의 분리를 위해 유전자 변형(예: PdgfrαH2BeGFP) 또는 야생형(WT) 마우스를 사용합니다. WT 마우스를 사용할 때 항체 염색을 수행하여 FACS를 통해 간질에서 특정 섬유아세포 하위 집단을 분리합니다. 마우스를CO2 질식에 의해 안락사시킨다. 집게와 해부 가위를 사용하여 식도를 해부합니다. 식도 전체를 제거하려면 위 바로 위의 식도 말단과 기관 시작 부분의 근위 끝을 자릅니다. 식도를 PBS에 담그고 얼음 위에 올려 놓습니다. 해부 현미경(총 배율 범위 8x-40x)과 겸자를 사용하여 외근근을 기계적으로 제거합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 해부된 식도의 말단부를 잡고 다른 집게를 사용하여 해부된 식도의 원위부에서 근위부까지 근육을 잡고 당깁니다. 근육층을 제거하고 버립니다. 식도를 세로로 엽니다. 이것은 조직 손상을 방지하기 위해 볼 팁이 있는 미세 해부 스프링 가위를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 식도의 한쪽 끝을 잡고 스프링 가위의 볼을 식도 내강에 삽입하고 끝을 잡고 식도를 잘라냅니다. 식도를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브 또는 24웰 플레이트에 넣습니다. 열린 식도를 HBSS의 0.5mg/mL thermolysin에서 37°C의 로커 셰이커에서 15분 동안 배양합니다. 식도를 thermolysin 용액에 완전히 담그십시오.알림: 사용되는 Thermolysin 용액의 부피는 웰 또는 튜브 크기에 따라 다릅니다. 여러 식도를 같은 우물이나 튜브에 넣고 잠글 수 있습니다. thermolysin 용액에서 식도를 꺼냅니다. 해부 현미경을 사용하여 식도 상피를 기질에서 조심스럽게 분리합니다. 가는 집게를 사용하여 조직의 상피 쪽과 기질 쪽을 모두 잡고 천천히 당겨 두 층을 분리합니다.참고: 간질은 투명한 상피와 달리 흰색과 불투명한 모양으로 식별됩니다. 간질은 고유층과 점막하 층을 포함합니다. 상피층과 기질층을 HBSS에서 200μL의 해리 용액과 함께 두 개의 분리된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 얼음 위에 올려 놓으십시오. 3. 식도 전구 세포의 분리 참고: 식도 전구 세포(2단계)와 섬유아세포(3단계)의 분리를 동시에 수행할 수 있습니다. HBSS(1% FBS)에서 1% FBS의 50mL 튜브를 준비합니다. 분리된 식도 상피를 1.5mL 미세 원심분리 튜브(단계 2.8)에서 깨끗한 페트리 접시로 옮기고 날카로운 메스를 사용하여 다진다. 200μL의 해리 용액과 함께 페트리 접시에서 다진 조직을 수집하고 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 다시 옮깁니다.참고: 200μL 피펫 팁을 사용하여 조각을 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 다시 넣을 수 있을 때 상피가 적절하게 다진 것입니다. 800 μL의 신선한 해리 용액을 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 총 부피 1 mL를 만듭니다.알림: 충분한 양의 해리 용액을 추가하는 것이 중요합니다. 1-3 식도 당 1mL의 용액을 권장합니다. 한 번에 더 많은 식도가 처리되면 확장됩니다. 다진 상피층이 있는 튜브를 37°C에서 60분 동안 로커-셰이커에 놓습니다. 소화를 향상시키기 위해 15분마다 200μL 피펫 팁을 사용하여 용액을 약 20회 위아래로 피펫팅합니다. 60분 후, 200 μL 피펫 팁을 사용하여 다시 20회 위아래로 피펫팅합니다. 용액을 40μm 셀 스트레이너를 통해 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 통과시킵니다. 4 °C에서 10분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.알림: 세포가 필터에 부착되는 것을 최소화하기 위해 세포를 변형시키기 전에 1% FBS로 세포 여과기를 적십니다. 상피는 완전히 소화되지 않으며 조직 조각은 여전히 볼 수 있습니다. 그러나 배양 기간이 길어지면 세포 생존율이 감소하고 생존 가능한 세포의 수율이 높아지지 않습니다. 1mL 피펫으로 과량의 액체를 제거하여 상청액을 버리고 펠릿을 1% FBS 1mL에 재현탁합니다. 4 °C에서 10분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.원심분리 동안, 식도 전구 세포의 FACS에 대한 접합된 항체 혼합물을 준비한다. 100만 개의 세포당 1% FBS의 200μL에 1μL의 CD324-PE-Cy7(ECADHERIN) 및 CD104-A647(INTEGRIN-β4)을 혼합합니다.참고: 1μL의 항체(최종 부피 200μL)는 1개 또는 2개의 식도에 충분합니다. 한 번에 더 많은 식도를 처리 할 때 항체 염색 용액의 부피를 늘리십시오. 펠릿을 200μL의 항체 혼합물에 재현탁하고 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 형광 항체를 추가한 후 신호 표백을 방지하기 위해 세포 현탁액을 어둠 속에 보관하십시오. 세포를 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 3mL의 1% FBS를 추가하고 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한 다음 1% FBS의 최소 200μL에 세포를 재현탁합니다.참고: 500 μL의 1% FBS는 최대 4개 또는 5개의 식도에 사용됩니다. 한 번에 더 많은 식도가 처리될 때 부피를 증가시켜 100-300 events/s의 FACS 유속을 달성할 수 있습니다. 이벤트/초가 많을수록 분류 효율이 감소하고 유속이 증가하면 세포 생존이 감소합니다. 살아있는 세포를 분리하기 위해 FACS 분류 5분 전에 1:10,000의 최종 농도에 죽은 세포 염색 마커를 추가합니다. FACS 기계를 사용하여 전구 세포를 정렬합니다(게이팅 전략은 그림 1 참조). 200μL의 염기성 오가노이드 배지로 채워진 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 세포를 수집합니다(표 1). 4. 기질층에서 섬유아세포 분리 해부 가위를 사용하여 200μL의 해리 용액이 들어 있는 1.5mL 튜브(2.8단계)에서 장루층을 미세한 조각으로 자릅니다. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 용액을 위아래로 피펫팅할 수 있게 되면 조직을 적절하게 다집니다. 800 μL의 신선한 해리 용액을 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 총 부피 1 mL를 만듭니다.알림: 충분한 양의 해리 용액을 추가하는 것이 중요합니다. 1-3 식도 당 1mL의 용액을 권장합니다. 한 번에 더 많은 식도가 처리되면 확장됩니다. 튜브를 37°C의 로커 셰이커에 30분 동안 놓습니다. 15분 후, 200μL 피펫 팁을 사용하여 용액을 약 20회 위아래로 피펫팅하여 소화를 개선합니다. 효소 분해 30분 후, 200 μL 피펫 팁을 사용하여 20회 더 위아래로 피펫팅합니다. 70μm 세포 여과기를 통해 용액을 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 걸러냅니다. 4 °C에서 10분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.알림: 세포가 필터에 부착되는 것을 최소화하기 위해 세포를 걸러내기 전에 1% FBS로 세포 여과기를 적십니다. 1mL 피펫으로 과량의 액체를 제거하여 상청액을 버리고 펠릿을 1% FBS 1mL에 재현탁합니다. 4 °C에서 10분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.참고: 형광 표지 섬유아세포를 포함하는 유전자 변형 마우스 균주를 사용하는 경우 항체 염색은 선택 사항입니다. 항체 염색이 필요하지 않은 경우 3.7단계를 계속 진행하여 샘플을 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.원심분리 동안, 섬유아세포의 FACS 분리를 위해 접합된 항체 혼합물을 준비한다. 100만 개의 세포당 1% FBS의 200μL에 1μL의 CD26-APC(DPP4)를 혼합합니다.참고: 1μL의 항체는 1개 또는 2개의 식도에 충분합니다. 한 번에 더 많은 식도를 처리 할 때 항체 염색 용액의 부피를 늘리십시오. 1% FBS에 혼합된 접합 항체 혼합물 200μL에 펠릿을 재현탁하고 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 세포를 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 3mL의 1% FBS를 넣고 4°C에서 10분 동안 300 x g 로 원심분리합니다. FBS의 1%의 최소 200μL에 세포를 재현탁합니다.참고: 500 μL의 1% FBS는 최대 4개 또는 5개의 식도에 사용됩니다. 한 번에 더 많은 식도를 처리할 때 부피를 증가시켜 100-300 events/s의 유속을 달성할 수 있습니다. 이벤트/초가 많을수록 분류 효율이 감소하고 유속이 증가하면 세포 생존이 감소합니다. 형광 항체를 첨가한 후 신호 표백을 방지하기 위해 세포 현탁액을 어둡게 유지해야 합니다. 살아있는 세포를 분리하기 위해 FACS 분류 5분 전에 1:10,000의 최종 농도에 죽은 세포 염색 마커를 추가합니다. FACS 기계를 사용하여 셀을 정렬합니다(게이팅 전략은 그림 1 참조). 200μL의 염기성 오가노이드 배지로 채워진 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 세포를 수집합니다(표 1). 5. 식도 오가노이드의 확립과 배양 참고: 예열ER저 (오가노이드 공동 배양), ENR(오가노이드) 배지(설명은 표 1 참조), 및 37°C에서 48-웰 플레이트. 해동된 매트릭스(1단계에서 준비됨) 분취액을 얼음 위에 놓습니다. 여기에 제공된 매트릭스( 재료 표 참조)를 마우스 식도 오가노이드 배양에 사용하는 것이 권장되는데, 이는 다른 브랜드의 매트릭스가 오가노이드 형성 효율에 부정적인 영향을 미치기 때문입니다. 오가노이드 공동 배양의 경우, 분류된 상피 세포와 섬유아세포를 튜브에서 1:2의 비율로 혼합합니다. 각 매트릭스 돔에 대해 5,000개의 상피 세포와 10,000개의 섬유아세포를 사용합니다. 더 많은 돔을 준비할 때 하나의 튜브에 5,000개의 상피 세포와 10,000개의 섬유아세포를 추가합니다. 섬유아세포가 없는 오가노이드 배양의 경우 매트릭스 돔당 5,000개의 상피 세포를 사용합니다. 혼합된 세포 집단을 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 200 μL 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 펠렛을 차가운 염기성 오가노이드 배지에 재현탁하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 한 번 세척합니다. 세포를 얼음 위에 놓습니다. 80% 매트릭스와 20% 차가운 염기성 오가노이드 배지로 구성된 혼합물을 준비합니다. 매트릭스가 실온(RT)에서 굳어지면서 모든 것을 얼음 위에 놓습니다. 원심분리 후 상층액을 200 μL 피펫으로 조심스럽게 제거하여 버립니다. 10μL의 매트릭스 믹스/돔에 세포를 재현탁하고 얼음 위에 다시 놓습니다. 37°C 인큐베이터에서 예열된 48웰 플레이트를 가져와서 20μL 피펫을 사용하여 웰당 하나의 매트릭스 돔을 만듭니다. 각 돔에는 10μL의 80% 매트릭스, 5,000개의 상피 세포 및 10,000개의 섬유아세포가 포함되어 있습니다. 플레이트를 거꾸로 인큐베이터로 옮기고 돔을 37°C에서 20-30분 더 굳힙니다.참고: 매트릭스 돔 부피의 감소 및/또는 세포 수의 증가는 오가노이드 형성 효율에 영향을 미칩니다. 200μL의 예열된 ER저 배지(표 1)를 오가노이드 공동 배양이 포함된 매트릭스 돔에 추가하고 ENR 배지(표 1)를 상피 오가노이드만 포함된 각 매트릭스 돔에 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 오가노이드를 37°C 및 5%CO2에서 성장시킨다. 처음 2일 동안은 배지에 10μM Rock-inhibitor(Y-27623)를 보충합니다. 암석 억제제는 스트레스로 인한 세포 사멸을 방지하고 오가노이드 배양의 성공적인 확립 가능성을 높입니다. 2-3 일마다 매체를 새로 고칩니다. 온도에 민감한 매트릭스의 해리를 방지하기 위해 매체가 따뜻한지 확인하십시오. 도금 후 6-8일 후에 실험 분석을 수행한다. 오가노이드는 최대 14일 동안 배양할 수 있습니다. 14일째 경에, 돔 무결성의 손실이 관찰된다. 6. 오가노이드의 패시징 참고: 공동 배양에서 성장한 오가노이드의 계대배양은 섬유아세포의 손실을 초래합니다. 따라서 계대 시 모든 오가노이드에 대해 ENR 배지를 사용하는 것이 좋습니다. ENR, PBS, 및 48-웰 플레이트를 37°C에서 예열하였다. 배지를 제거하고, 매트릭스 돔을 함유하는 웰을 예열된 PBS로 세척한다. 차가운 0.25% 트립신 용액 200μL를 추가하고 위아래로 피펫을 넣어 매트릭스 돔을 부수십시오.참고: 매트릭스가 온도에 민감하고 매트릭스 돔을 분해하는 데 도움이 되기 때문에 차가운 0.25% 트립신을 사용하는 것이 좋습니다. 오가노이드를 트립신과 함께 37°C에서 ~20분 동안 배양합니다. 오가노이드의 해리를 증가시키기 위해 10분 후에 위아래로 피펫팅합니다. 5-10분마다 현미경으로 해리 과정을 모니터링합니다. 트립신은 세포 생존력을 감소시키기 때문에 이상적인 해리 시간을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 20분 후, 200μL 피펫으로 오가노이드를 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 해리합니다. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 세포를 모으고 1mL의 기본 오가노이드 배지를 추가하고 RT에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 선택 사항: 최상의 오가노이드 성장 조건을 보장하고 새로운 오가노이드가 단일 세포에서 파생되도록 하려면 미리 습윤된 40μm 세포 여과기를 통해 세포를 변형시킵니다. 세포 현탁액을 여과하면 해리하기 어려운 오가노이드 코어와 세포 덩어리가 제거됩니다. 80% 매트릭스와 20% 저온 염기성 오가노이드 배지로 구성된 매트릭스 혼합물을 준비합니다. 매트릭스가 RT에서 굳어지면서 모든 것을 얼음 위에 놓습니다. 200μL 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하여 버리고 10μL의 매트릭스 믹스/돔에 세포를 재현탁한 다음 혼합물을 다시 얼음에 놓습니다.참고: 오가노이드는 돔 밀도에 따라 1:5에서 1:10 비율로 분할할 수 있습니다. 상피 세포는 또한 5,000 세포/돔에서 계수 및 재도금될 수 있습니다. 37°C 인큐베이터에서 예열된 48웰 플레이트를 취하여 웰당 하나의 돔을 만듭니다. 플레이트를 거꾸로 인큐베이터로 옮기고 돔을 37°C에서 20-30분 더 굳힙니다. 예열된 ENR 배지 200μL를 각 오가노이드 돔에 추가합니다. 처음 2일 동안 배지에 10μM Rock-inhibitor(Y-27623)를 보충합니다. 2-3 일마다 매체를 새로 고칩니다. 온도에 민감한 매트릭스의 해리를 방지하기 위해 매체가 따뜻한지 확인하십시오. 7. 전체 마운트 염색을 위한 오가노이드 가공 알림: 오가노이드가 플라스틱에 달라붙지 않도록 사용하기 전에 팁과 튜브를 PBS에 10% FBS로 코팅하십시오. 피펫 팁의 경우 팁을 사용하기 전에 10% FBS/PBS 용액에서 위아래로 한 번 또는 두 번 피펫팅하는 것으로 충분합니다. 튜브의 경우 튜브에 10% FBS/PBS를 채운 다음 용액을 제거합니다. 오가노이드 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 200μL를 매트릭스 돔에 추가합니다. 접시를 얼음 위에 5-10분 동안 놓습니다. 위아래로 피펫팅하고 용액을 0.6mL 마이크로 원심분리기 비부착 튜브로 옮깁니다. 오가노이드가 바닥에 가라앉을 수 있도록 100 x g 에서 30-60초 동안 잠시 원심분리합니다.참고: 과도한 피펫팅과 긴 원심분리는 오가노이드를 파괴하고 섬유아세포-오가노이드 상호작용을 방해합니다. 과도한 액체를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS를 첨가하십시오. 오가노이드가 바닥에 가라앉을 수 있도록 100 x g 에서 30-60초 동안 잠시 원심분리합니다. 과도한 액체를 제거하고 얼음에서 30분 동안 PBS 용액에 차가운 4% 포름알데히드 200μL로 오가노이드를 고정합니다.주의 : 포름알데히드는 독성이 있으므로 항상 화학 흄 후드에 사용해야 합니다. 니트릴 장갑, 보안경 및 실험복은 항상 착용해야 합니다. 오가노이드를 고정하면 오가노이드가 가라앉고 더 이상 원심분리가 필요하지 않습니다. 튜브를 똑바로 세워 오가노이드가 가라앉도록 하고 2-3분 정도 기다렸다가 포름알데히드를 제거하고 차가운 PBS 500μL를 추가하여 포름알데히드를 씻어냅니다. 오가노이드를 가라앉히고 과도한 PBS를 제거한 다음 신선하고 차가운 PBS 500μL를 추가합니다. 오가노이드를 가라앉히고 과도한 PBS를 제거한 다음 500μL의 차단 완충액(PBS에서 5% 정상 당나귀 혈청, 1% BSA 및 0.5% Triton X-100)을 추가합니다. RT에서 60 분 동안 로커 셰이커에 튜브를 놓습니다.알림: 차단은 4°C에서 하룻밤(O/N)으로 수행할 수도 있습니다. 오가노이드를 가라앉히고 블로킹 버퍼를 제거한 다음 1차 항체가 있는 블로킹 버퍼 200μL에 오가노이드를 다시 현탁합니다( 재료 표 참조). 오가노이드를 4°C의 로커 셰이커 O/N에 보관합니다.참고: 핵 단백질, 저발현 단백질 또는 비특이적 염색을 나타내는 항체의 염색을 개선하기 위해 4°C에서 1일 또는 2일 동안 배양 시간을 늘릴 수 있습니다. 오가노이드를 로커 셰이커에 올려놓는 것은 오가노이드가 뭉치는 것을 방지하고 염색 효율을 높이기 때문에 필수적입니다. 오가노이드를 가라앉히고 1차 항체 혼합물을 제거한 다음 PBS(0.02% Tx) 중 0.02% Triton X-100 500μL를 사용하여 RT에서 60분 동안 오가노이드를 세척합니다.참고: 더 긴 1차 항체 배양이 필요한 경우 4°C에서 PBS O/N에 0.02% Tx로 세척 단계를 추가합니다. 오가노이드를 가라앉히고 세척 완충액을 제거한 다음 4°C의 블로킹 완충액 O/N에 형광 결합 2차 항체 200μL를 추가합니다. 형광 2차 항체를 추가한 후 신호의 표백을 방지하기 위해 오가노이드를 어두운 곳에 보관하십시오. 오가노이드를 가라앉히고 2차 항체 혼합물을 제거한 다음 RT에서 60분 동안 0.02% Tx 500μL를 사용하여 오가노이드를 세척합니다. 필요한 경우 핵 염색을 위해 200μL의 DAPI(0.25μg/mL) 용액으로 오가노이드를 반대 염색합니다. 로커-셰이커(rocker-shaker)의 RT에서 60분 동안 샘플을 배양합니다. 오가노이드를 가라앉히고 DAPI 용액을 제거하고 오가노이드를 500μL의 PBS로 RT에서 15분 동안 세척합니다. 오가노이드를 가라앉히고 과도한 액체를 모두 제거합니다. 오가노이드에 투명 용액 10μL를 추가하고 RT에서 15분 동안 배양합니다.참고: 세척 용액은 점성이 있으므로 세척 용액을 피펫팅하기 전에 20μL 피펫 팁의 바깥쪽 부분을 잘라냅니다. 더 큰 스페이서가 이미징에 사용되는 경우 더 많은 투명 용액을 추가할 수 있습니다. 오가노이드를 투명화하지 않을 때 세척액 대신 마운팅 용액을 사용할 수 있습니다. 클리어링 솔루션은 이미징 시 배경을 줄이고 이미징 깊이를 증가시킵니다. 현미경 슬라이드에 0.05mm 양면 끈적끈적한 4웰 스페이서를 놓습니다. 오가노이드와 함께 10μL의 투명 용액을 하나의 웰에 넣고 스페이서 위에 커버 슬립을 놓습니다.알림: 오가노이드는 스페이서를 사용하지 않고도 장착할 수 있습니다. 스페이서는 오가노이드 모양을 그대로 유지하고 오가노이드가 평평해지는 것을 방지합니다. 슬라이드를 RT O/N으로 유지하여 오가노이드를 제거합니다. 장기간 보관하려면 슬라이드를 4°C로 보관하십시오. 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다.