Функциональная характеристика и визуализация фибробластов пищевода с использованием органоидных кокультур

Эксперименты на животных для этого исследования были одобрены Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (этическое разрешение No 14051-2019). Животные были размещены в условиях, свободных от патогенов, в соответствии с рекомендациями Федерации Европейской ассоциации лабораторных животных. 1. Подготовка Разморозьте ферментативные исходные растворы, используемые для диссоциации (см. Таблицу материалов), на льду. Размораживание аликвоты матрицы базальной мембраны (матрицы) с пониженным фактором роста (СКФ) при 4 °C. Подготовьте питательную среду. Используйте среду, описанную в таблице 1 для органоидных культур и кокультур, и подготовьте ее перед началом протокола. 2. Рассечение и разделение эпителия пищевода и стромы ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все инструменты, используемые для вскрытия и обработки тканей, стерильны. Приготовьте 2 мл диссоциативного раствора (см. Таблицу материалов) в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) на три пищевода. Используйте выбранный штамм мыши, например мыши C57BL/6J. Развитие пищевода у мышей заканчивается после послеродового дня (p) 70, поэтому рекомендуется использовать мышей старше p7013. Используйте четырех или пять мышей, так как они обеспечивают достаточное количество материала для создания 8-10 органоидных кокультур.ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность органоидообразования снижается с возрастом мышей. Если представляют интерес конкретные субпопуляции фибробластов, возможно, что низкий выход фибробластов ограничивает количество органоидных кокультур, которые могут быть установлены. Используйте генетически модифицированных (например, PdgfrαH2BeGFP) или мышей дикого типа (WT) для выделения популяций фибробластов. При использовании мышей WT выполняйте окрашивание антител, чтобы выделить специфические субпопуляции фибробластов из стромы с помощью FACS. Усыпляют мышей путем удушья CO2 . Рассекают пищевод с помощью щипцов и диссекционных ножниц. Чтобы удалить весь пищевод, отрежьте дистальный конец пищевода непосредственно над желудком и проксимальный конец в начале трахеи. Погрузите пищевод в PBS и положите его на лед. Механически удаляют наружную мышцу с помощью диссекционного микроскопа (общий диапазон увеличения 8x-40x) и щипцов. Удерживайте дистальный конец рассеченного пищевода с помощью одной пары щипцов, а другими щипцами захватывайте и тяните мышцу от дистального к проксимальному концу рассеченного пищевода. Удалите и выбросьте мышечный слой. Откройте пищевод в продольном направлении. Лучше всего это работает с использованием пружинных ножниц для микродиссекции с шариковым наконечником, чтобы предотвратить повреждение тканей. Возьмитесь за один конец пищевода, чтобы вставить шарик пружинных ножниц в просвет пищевода и разрежьте пищевод, держась за конец. Поместите пищевод в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл или 24-луночную пластину. Инкубировать открытый пищевод в 0,5 мг/мл термолизина в HBSS при 37 °C на коромысле-шейкере в течение 15 мин. Полностью погрузите пищевод в раствор термолизина.ПРИМЕЧАНИЕ: Объем используемого раствора термолизина зависит от размера лунки или трубки. Несколько пищеводов могут быть помещены и погружены в одну и ту же лунку или трубку. Извлеките пищевод из раствора термолизина. Используйте диссекционный микроскоп, чтобы аккуратно отделить эпителий пищевода от стромы. Используя тонкие щипцы, возьмите как эпителиальную, так и стромальную сторону ткани и медленно раздвиньте их, чтобы разделить два слоя.ПРИМЕЧАНИЕ: Строма идентифицируется по ее белому и непрозрачному виду, в отличие от прозрачного эпителия. Строма содержит собственную пластинку и подслизистый слой. Перенесите эпителиальный и стромальный слой в две отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с 200 мкл диссоциативного раствора в HBSS. Положите на лед. 3. Выделение клеток-предшественников пищевода ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение клеток-предшественников пищевода (шаг 2) и фибробластов (шаг 3) может быть выполнено одновременно. Подготовьте пробирку объемом 50 мл с 1% FBS в HBSS (1% FBS). Перенесите отделенный эпителий пищевода из микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл (этап 2.8) в чистую чашку Петри и используйте острый скальпель для измельчения. Соберите измельченную ткань из чашки Петри с 200 мкл диссоциативного раствора и перенесите ее обратно в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителий измельчается должным образом, когда кусочки могут быть помещены обратно в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Добавьте 800 мкл свежего диссоциирующего раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл до общего объема 1 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно добавить достаточный объем диссоциационного раствора. На один-три пищевода рекомендуется 1 мл раствора. Увеличьте масштаб, когда одновременно обрабатывается больше эзофагов. Поместите пробирку с измельченным эпителиальным слоем на коромысло при температуре 37 °C на 60 мин. Пипеткой вводите раствор вверх и вниз примерно 20 раз, используя наконечник пипетки объемом 200 мкл каждые 15 минут, чтобы улучшить пищеварение. Через 60 минут пипетка вверх и вниз еще 20 раз с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Пропустите раствор через сетчатый фильтр 40 мкм в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Смочите сетчатый фильтр 1% FBS перед процеживанием клеток, чтобы свести к минимуму прилипание клеток к фильтру. Эпителий полностью не переварится, и кусочки ткани все равно будут видны. Однако более длительная инкубация снизит выживаемость клеток и не приведет к более высокому выходу жизнеспособных клеток. Откажитесь от надосадочной жидкости, удалив лишнюю жидкость пипеткой объемом 1 мл, и ресуспендируйте гранулу в 1 мл 1% FBS. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.Во время центрифугирования готовят смесь конъюгированных антител для FACS клеток-предшественников пищевода. Смешайте 1 мкл CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) и CD104-A647 (INTEGRIN-β4) в 200 мкл 1% FBS на миллион клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мкл антитела (конечный объем 200 мкл) достаточно для одного или двух пищеводов. При обработке сразу большего количества эзофагов увеличьте объем раствора для окрашивания антител. Ресуспендировать гранулу в 200 мкл смеси антител и перенести в проточную цитометрическую пробирку. После добавления флуоресцентных антител храните клеточные суспензии в темноте, чтобы избежать обесцвечивания сигнала. Инкубировать клетки в течение 30 мин при 4 °C. Добавьте 3 мл 1% FBS и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 ° C, а затем ресуспендируйте клетки минимум в 200 мкл 1% FBS.ПРИМЕЧАНИЕ: 500 мкл 1% FBS используется для четырех или пяти пищеводов. Увеличьте объем, когда одновременно обрабатывается больше пищевода, чтобы можно было достичь скорости потока FACS 100-300 событий / с. Большее количество событий/с снизит эффективность сортировки, а увеличение скорости потока снизит выживаемость клеток. Добавьте маркер окрашивания мертвых клеток до конечной концентрации 1:10 000 за 5 минут до сортировки FACS, чтобы выделить живые клетки. Отсортируйте клетки-предшественники с помощью машины FACS (см. рис. 1 для стратегии стробирования). Соберите клетки в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, заполненные 200 мкл основной органоидной среды (табл. 1). 4. Выделение фибробластов из стромального слоя Разрежьте слой стомы на мелкие кусочки в пробирке объемом 1,5 мл, содержащей 200 мкл диссоциирующего раствора (этап 2.8), с помощью ножниц для рассечения. Ткань должным образом измельчается после того, как раствор можно пипетировать вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Добавьте 800 мкл свежего диссоциирующего раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл до общего объема 1 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно добавить достаточный объем диссоциационного раствора. На один-три пищевода рекомендуется 1 мл раствора. Увеличьте масштаб, когда одновременно обрабатывается больше эзофагов. Поместите трубку на шейкер при температуре 37 °C на 30 минут. Через 15 минут нанесите раствор пипеткой вверх и вниз примерно 20 раз, используя наконечник пипетки объемом 200 мкл для улучшения пищеварения. После 30 минут ферментативного сбраживания пипетка вверх и вниз еще 20 раз с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Процедите раствор через сетчатое фильтр для клеток 70 мкм в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Перед процеживанием клеток смочите сетчатый фильтр 1% FBS, чтобы свести к минимуму прилипание клеток к фильтру. Откажитесь от надосадочной жидкости, удалив лишнюю жидкость пипеткой объемом 1 мл, и ресуспендируйте гранулу в 1 мл 1% FBS. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании генетически модифицированного штамма мыши, содержащего флуоресцентно меченные фибробласты, окрашивание антителами не является обязательным. Если окрашивание антителами не требуется, перейдите к шагу 3.7 и перенесите образец в проточную цитометрическую пробирку.Во время центрифугирования готовят смесь конъюгированных антител для выделения фибробластов FACS. Смешайте 1 мкл CD26-APC (DPP4) с 200 мкл 1% FBS на один миллион клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мкл антитела достаточно для одного или двух пищеводов. При обработке сразу большего количества эзофагов увеличьте объем раствора для окрашивания антител. Ресуспендировать гранулу в 200 мкл смеси конъюгированных антител в 1% FBS и перенести в проточную цитометрическую пробирку. Инкубировать клетки в течение 30 мин при 4 °C. Добавьте 3 мл 1% FBS и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 ° C. Ресуспендировать клетки в концентрации не менее 200 мкл 1% ФБС.ПРИМЕЧАНИЕ: 500 мкл 1% FBS используется для четырех или пяти пищеводов. Увеличьте объем, когда одновременно обрабатывается больше эзофагов, чтобы можно было достичь скорости потока 100-300 событий / с. Большее количество событий/с снизит эффективность сортировки, а увеличение скорости потока снизит выживаемость клеток. После добавления флуоресцентных антител клеточные суспензии следует держать в темноте, чтобы избежать обесцвечивания сигнала. Добавьте маркер окрашивания мертвых клеток до конечной концентрации 1:10 000 за 5 минут до сортировки FACS, чтобы выделить живые клетки. Отсортируйте ячейки с помощью машины FACS (см. рис. 1 для стратегии стробирования). Соберите клетки в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, заполненные 200 мкл основной органоидной среды (табл. 1). 5. Создание и культивирование органоидов пищевода ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно прогретыйER low (органоидная совместная культура), ENR (органоидная) среда (см. Таблицу 1 для описания) и 48-луночная пластина при 37 ° C. Размороженную матрицу (подготовленную на шаге 1) аликвоту выложить на лед. Для культуры органоидов пищевода мышей рекомендуется использовать приведенную здесь матрицу (см. Таблицу материалов), так как другие марки матрицы отрицательно влияют на эффективность формирования органоидов. Для совместной культуры органоидов смешайте отсортированные эпителиальные клетки и фибробласты в пробирке в соотношении 1:2. Для каждого матричного купола используют 5000 эпителиальных клеток и 10000 фибробластов. При подготовке к большему количеству куполов добавьте в одну пробирку 5000 эпителиальных клеток и 10000 фибробластов. Для органоидных культур без фибробластов используйте 5000 эпителиальных клеток на матричный купол. Центрифугируйте смешанную клеточную популяцию при 300 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, осторожно удалив ее пипеткой объемом 200 мкл. Промойте клетки один раз, ресуспендировав гранулу в холодной основной органоидной среде и центрифуге при 300 x g в течение 5 мин. Поместите клетки на лед. Готовят смесь, состоящую на 80% из матрицы и на 20% из холодной основной органоидной среды. Положите все на лед, пока матрица затвердевает при комнатной температуре (RT). Выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования, осторожно удалив ее пипеткой объемом 200 мкл. Ресуспендируют клетки в 10 мкл матричной смеси/купола и снова кладут на лед. Возьмите предварительно разогретую 48-луночную пластину из инкубатора с температурой 37 °C и сделайте по одному матричному куполу на лунку с помощью пипетки объемом 20 мкл. Каждый купол содержит 10 мкл 80% матрикса, 5000 эпителиальных клеток и 10 000 фибробластов. Переложите тарелку вверх дном в инкубатор и дайте куполам застыть еще 20-30 минут при 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшение объема матричного купола и/или увеличение количества ячеек повлияет на эффективность формирования органоидов. Добавьте 200 мкл предварительно разогретойнизкой среды ER (таблица 1) к матричным куполам, содержащим органоидные кокультуры, и среду ENR (таблица 1) к соответствующим матричным куполам, содержащим только эпителиальные органоиды, и поместите планшет в инкубатор. Выращивайте органоиды при 37 ° C и 5% CO2. В течение первых 2 дней дополняйте среду 10 мкМ Rock-ингибитором (Y-27623). Ингибитор горных пород предотвращает вызванную стрессом гибель клеток и увеличивает вероятность успешного укоренения органоидных культур. Обновляйте средство каждые 2-3 дня. Убедитесь, что среда теплая, чтобы предотвратить диссоциацию термочувствительной матрицы. Проведите анализ эксперимента через 6-8 дней после нанесения покрытия. Органоиды могут храниться в культуре до 14 дней. Примерно на 14 день наблюдается потеря целостности купола. 6. Пассаж органоидов ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж органоидов, выращенных в совместной культуре, приводит к потере фибробластов. Поэтому рекомендуется использовать среду ENR для всех органоидов при прохождении. Предварительно разогрейте ENR, PBS и 48-луночную пластину при 37 °C. Удалите среду и промойте колодец, содержащий матричный купол, предварительно разогретым PBS. Добавьте 200 мкл холодного 0,25% раствора трипсина и пипетку вверх и вниз, чтобы разрушить матричный купол.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать холодный 0,25% трипсина, так как матрица чувствительна к температуре, и это помогает разрушать купола матрицы. Инкубируйте органоиды с трипсином при 37 °C в течение ~20 мин. Пипеткой вверх и вниз через 10 мин, чтобы увеличить диссоциацию органоидов. Контролируйте процесс диссоциации с помощью микроскопа каждые 5-10 мин. Поскольку трипсин снижает жизнеспособность клеток, это может помочь определить идеальное время диссоциации. Через 20 минут органоиды пипеткой вверх и вниз пипеткой объемом 200 мкл для диссоциации органоидов. Соберите клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 1 мл основной органоидной среды и центрифугу при 300 x g в течение 5 мин при ЛТ. Необязательно: Чтобы обеспечить наилучшие условия роста органоидов и получение новых органоидов из отдельных клеток, процедите клетки через предварительно смачиваемый клеточный фильтр размером 40 мкм. Фильтрация клеточной суспензии приводит к удалению органоидных ядер и клеточных скоплений, которые трудно диссоциировать. Приготовьте матричную смесь, состоящую из 80% матрицы и 20% холодной основной органоидной среды. Положите все на лед, пока матрица застывает при RT. Выбросьте надосадочную жидкость, осторожно удалив ее пипеткой объемом 200 мкл, ресуспендируйте клетки в 10 мкл матричной смеси/купола и положите смесь обратно на лед.ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут быть разделены в соотношении от 1:5 до 1:10, в зависимости от плотности купола. Эпителиальные клетки также могут быть подсчитаны и повторно покрыты в количестве 5000 клеток / купол. Возьмите предварительно разогретую 48-луночную тарелку из инкубатора с температурой 37 °C и сделайте по одному куполу на лунку. Переложите тарелку вверх дном в инкубатор и дайте куполам застыть еще 20-30 минут при 37 °C. Добавьте 200 мкл предварительно разогретой среды ENR в соответствующие органоидные купола. Дополните среду 10 мкМ ингибитором горных пород (Y-27623) в течение первых 2 дней. Обновляйте средство каждые 2-3 дня. Убедитесь, что среда теплая, чтобы предотвратить диссоциацию термочувствительной матрицы. 7. Обработка органоидов для окрашивания всего крепления ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием покройте наконечники и трубки 10% FBS в PBS, чтобы избежать прилипания органоидов к пластику. Для наконечников для пипеток достаточно один или два раза пипеткой вверх и вниз в 10% растворе FBS / PBS перед использованием наконечника. Для пробирок заполните пробирку 10% FBS/PBS, а затем удалите раствор. Удалите органоидную среду и добавьте 200 мкл ледяного PBS в матричные купола. Поставьте тарелку на лед на 5-10 минут. Пипеткой вверх и вниз и перенесите раствор в микроцентрифужные неадгезионные пробирки объемом 0,6 мл. Центрифугу в течение 30-60 с при 100 x g , чтобы органоиды осели на дне.ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточное пипетирование и длительное центрифугирование разрушают органоиды и нарушают взаимодействие фибробластов и органоидов. Удалите лишнюю жидкость и добавьте ледяной PBS. Центрифугу в течение 30-60 с при 100 x g , чтобы органоиды осели на дне. Удалите лишнюю жидкость и зафиксируйте органоид 200 мкл холодного 4% формальдегида в растворе PBS на 30 мин на льду.ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен и всегда должен использоваться в химическом вытяжном шкафу. Всегда необходимо носить нитриловые перчатки, защитные очки и лабораторные халаты. Фиксация органоида приводит к тому, что они опускаются, и центрифугирование больше не требуется. Дайте органоидам утонуть, поместив трубку вертикально, и подождите 2-3 минуты, удалите формальдегид и добавьте 500 мкл холодного PBS, чтобы смыть формальдегид. Дайте органоидам утонуть, удалите излишки PBS и добавьте 500 мкл свежего холодного PBS. Дайте органоидам утонуть, удалите излишки PBS и добавьте 500 мкл блокирующего буфера (5% нормальной ослиной сыворотки, 1% BSA и 0,5% Triton X-100 в PBS). Поместите трубку на коромысла-шейкер на 60 мин при RT.ПРИМЕЧАНИЕ: Блокировка также может быть выполнена в течение ночи (O / N) при 4 ° C. Дайте органоидам опуститься, удалите блокирующий буфер и ресуспендируйте органоиды в 200 мкл блокирующего буфера с первичными антителами (см. Таблицу материалов). Храните органоиды на коромысле-шейкере O/N при температуре 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения окрашивания ядерных белков, низкоэкспрессированных белков или антител, которые проявляют неспецифическое окрашивание, время инкубации может быть увеличено на 1 или 2 дня при 4 ° C. Размещение органоидов на коромысле имеет важное значение, поскольку это предотвращает слипание органоидов и повышает эффективность окрашивания. Дайте органоидам утонуть, удалите смесь первичных антител и промойте органоиды, используя 500 мкл 0,02% Triton X-100 в PBS (0,02% Tx) в течение 60 минут при RT. Повторите три раза.ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется более длительная инкубация первичных антител, добавьте стадию промывки с 0,02% Tx в PBS O/N при 4 °C. Дайте органоидам утонуть, удалите промывочный буфер и добавьте 200 мкл флуоресцентно-конъюгированного вторичного антитела в блокирующий буфер O/N при 4 ° C. После добавления флуоресцентных вторичных антител держите органоиды в темноте, чтобы избежать обесцвечивания сигнала. Дайте органоидам утонуть, удалите смесь вторичных антител и промойте органоиды, используя 500 мкл 0,02% Tx в течение 60 мин при RT. Повторите три раза. При необходимости покрасьте органоиды 200 мкл раствора DAPI (0,25 мкг/мл) для ядерного окрашивания. Инкубируйте образцы в течение 60 мин при RT на коромысле-шейкере. Дайте органоидам втонуть, удалите раствор DAPI и промойте органоиды в 500 мкл PBS в течение 15 мин при RT. Повторите три раза. Дайте органоидам утонуть и удалите всю лишнюю жидкость. Добавьте 10 мкл очищающего раствора к органоидам и инкубируйте в течение 15 мин при RT.ПРИМЕЧАНИЕ: Очищающий раствор вязкий, поэтому перед пипеткой очистного раствора отрежьте внешнюю часть наконечника пипетки объемом 20 мкл. Больше решения для очистки может быть добавлено, если для визуализации используется большая прокладка. Монтажный раствор можно использовать вместо очищающего раствора, когда органоиды не очищаются. Очищающее решение уменьшает фон при визуализации и увеличивает глубину изображения. Поместите двустороннюю липкую 4-луночную спейсер диаметром 0,05 мм на предметное стекло микроскопа. Добавьте 10 мкл очищающего раствора с органоидами в одну лунку и поместите покровное стекло поверх прокладки.ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды также могут быть установлены без использования прокладки. Прокладка сохраняет форму органоида нетронутой и предотвращает сплющивание органоидов. Держите предметное стекло в точке RT O/N, чтобы очистить органоиды. Для длительного хранения храните предметные стекла при температуре 4 °C. Получение изображений с помощью системы конфокальной микроскопии.