Summary

Induzione della parodontite attraverso una combinazione di legatura e iniezione di lipopolisaccaridi in un modello di ratto

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

In questo studio, un modello di ratto di induzione della parodontite è presentato attraverso una combinazione di legatura ritentiva e iniezioni ripetitive di lipopolisaccaride derivato da Porphyromonas gingivalis, per 14 giorni intorno ai primi molari mascellari. Le tecniche di legatura e iniezione di LPS sono state efficaci nell’indurre la peridontite, con conseguente perdita ossea alveolare e infiammazione.

Abstract

La parodontite (PD) è una malattia immuno-infiammatoria cronica altamente prevalente del parodonto, che provoca una perdita dei tessuti molli gengivali, del legamento parodontale, del cemento e dell’osso alveolare. In questo studio, viene descritto un semplice metodo di induzione del PD nei ratti. Forniamo istruzioni dettagliate per il posizionamento del modello di legatura attorno ai primi molari mascellari (M1) e una combinazione di iniezioni di lipopolisaccaride (LPS), derivato da Porphyromonas gingivalis sul lato mesio-palatale della M1. L’induzione della parodontite è stata mantenuta per 14 giorni, promuovendo l’accumulo di biofilm batterico e l’infiammazione. Per convalidare il modello animale, IL-1β, un mediatore infiammatorio chiave, è stato determinato mediante un saggio immunologico nel liquido crevicolare gengivale (GCF) e la perdita ossea alveolare è stata calcolata utilizzando la tomografia computerizzata a fascio conico (CBCT). Questa tecnica è stata efficace nel promuovere la recessione gengivale, la perdita ossea alveolare e un aumento dei livelli di IL-1β nel GCF alla fine della procedura sperimentale dopo 14 giorni. Questo metodo è stato efficace nell’indurre la malattia di Parkinson, potendo così essere utilizzato in studi sui meccanismi di progressione della malattia e sui futuri possibili trattamenti.

Introduction

La parodontite (PD) è la sesta condizione di salute pubblica più diffusa in tutto il mondo, che colpisce circa l’11% della popolazione totale, essendo una forma avanzata, irreversibile e distruttiva di malattia parodontale 1,2. Il PD è un processo infiammatorio che colpisce i tessuti gengivali e parodontali, che provoca la recessione gengivale, la migrazione apicale dell’epitelio giunzionale con sviluppo della tasca e la perdita dell’osso alveolare3. Inoltre, la malattia di Parkinson è associata a diverse malattie sistemiche, tra cui malattie cardiovascolari, obesità, diabete e artrite reumatoide, per le quali i fattori ambientali e specifici dell’ospite svolgono un ruolo significativo 4,5.

Quindi, la malattia di Parkinson è una malattia multifattoriale iniziata principalmente dall’accumulo di placca microbica – derivante dalla disbiosi delle comunità microbiche – e da una risposta immunitaria esagerata dell’ospite ai patogeni parodontali, che porta alla rottura del tessuto parodontale 4,6. Tra i diversi batteri parodontali, il batterio anaerobico gram-negativo Porphyromonas gingivalis è uno dei patogeni chiave nel PD4. P. gingivalis contiene un complesso lipopolisaccaride (LPS) nelle sue pareti, una molecola nota per indurre infiltrazione leucocitaria polimorfonucleata e dilatazione vascolare nei tessuti parodontali infiammati7. Ciò si traduce nella produzione di mediatori infiammatori, come l’interleuchina 1 (IL-1), IL-6 e IL-8, fattore di necrosi tumorale (TNF) o prostaglandine, con una successiva attivazione degli osteoclasti e riassorbimento osseo, che porta alla distruzione dei tessuti e alla perdita finale dei denti3.

Tra i diversi vantaggi dei modelli animali c’è la capacità di imitare le complessità cellulari come negli esseri umani, o di essere più accurati rispetto agli studi in vitro , che vengono effettuati su superfici plastiche con tipi cellulari limitati8. Per modellare sperimentalmente il PD in vivo, sono state utilizzate diverse specie animali, come primati non umani, cani, maiali, furetti, conigli, topi e ratti9. Tuttavia, i ratti sono il modello animale più ampiamente studiato per la patogenesi del PD perché sono economici e facili da maneggiare10. Il loro tessuto gengivale dentale ha caratteristiche strutturali simili al tessuto gengivale umano, con un solco gengivale poco profondo e un epitelio giunzionale attaccato alla superficie del dente. Inoltre, come nell’uomo, l’epitelio giunzionale facilita il passaggio di batteri, materiali estranei ed essudati dalle cellule infiammatorie 9.

Uno dei modelli sperimentali più riportati di induzione del PD nei ratti è il posizionamento delle legature intorno ai denti, che è tecnicamente impegnativo ma affidabile10. Il posizionamento della legatura facilita la placca dentale e l’accumulo batterico, generando una disbiosi nei solchi gengivali, che causa infiammazione e distruzione del tessuto parodontale11. La perdita dell’attaccamento parodontale e il riassorbimento dell’osso alveolare potrebbero verificarsi in 7 giorni in questo ratto modello8.

Un altro modello animale per il PD consiste nell’iniezione di LPS nel tessuto gengivale. Di conseguenza, vengono stimolati l’osteoclastogenesi e la perdita ossea. Le caratteristiche istopatologiche di questo modello sono simili alla PD stabilita dall’uomo, caratterizzata da livelli più elevati di citochine proinfiammatorie, degradazione del collagene e riassorbimento osseo alveolare 6,8.

Pertanto, lo scopo di questo studio è stato quello di descrivere un semplice modello di ratto di PD sperimentale basato sulle tecniche di iniezioni di P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinato con il posizionamento della legatura attorno ai primi molari mascellari (M1). Si tratta di un modello con caratteristiche simili a quelle osservate nella malattia PD umana, che potrebbe essere utilizzato nello studio dei meccanismi di progressione della malattia e dei futuri possibili trattamenti.

Protocol

NOTA: Il protocollo sperimentale dello studio è stato approvato dal Comitato Etico di Sperimentazione Animale dell’Istituto di Ricerca Sanitaria delle Isole Baleari (CEEA-UIB; numero di riferimento 163/03/21). 1. Anestesia animale e preparazione della procedura Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (bavagli in alluminio, esploratore dentale, lancia diamantata, forbici chirurgiche, pinze microchirurgiche, un micro portaaghi, un intagliatore hollenback, un eleva…

Representative Results

Una sequenza temporale delle fasi sperimentali è presentata nella Figura 1. La figura 2A mostra un’immagine della mandibula dopo l’intervento chirurgico, con il posizionamento della legatura attorno al solco di M1 al tempo 0 dell’esperimento. La figura 2B mostra come, dopo 14 giorni dalla procedura, la legatura intorno alla M1 entra nel solco gengivale, causando infiammazione della gengiva e accumulo infiltrante. <p class="jove…

Discussion

Questo metodo descrive l’induzione del PD nei ratti seguendo una tecnica combinata di iniezioni di Pg-LPS e posizionamento della legatura intorno alla M1, rivelando che cambiamenti significativi nei tessuti parodontali e nell’osso alveolare potrebbero essere indotti in 14 giorni dopo questo metodo.

Durante questa procedura, deve essere fornita attenzione a diversi passaggi critici. Durante l’anestesia animale e la preparazione della procedura, valutare la corretta anestesia durante il…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), dall’Instituto de Salud Carlos III, dal Ministerio de Economía y Competividad, cofinanziato dal Fondo sociale europeo FSE e dal Fondo europeo di sviluppo regionale del FESR (contratto con M.M.B; FI18/00104) e dalla Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (contratto con M.M.F.C; FPI/040/2020). Gli autori ringraziano la dottoressa Anna Tomás e Maria Tortosa per il loro aiuto alla chirurgia sperimentale e alla piattaforma di IdISBa. Infine, grazie ad ADEMA School of Dentistry per l’accesso allo scanner CBCT.

Materials

Adsorbent paper point nº30  Proclinc 8187
Aprotinin Sigma-Aldrich A1153
Atipamezole Dechra 573751.5 Revanzol 5 mg/mL
Braided silk ligature (5/0)  Laboratorio Arago Sl 613112
Buprenorphine  Richter pharma 578816.6 Bupaq 0.3 mg/mL
Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner  MyRay hyperion X9 Model Hyperion X9
CTAn software SkyScan Version 1.13.4.0
Dental explorer  Proclinc 99743
Diamond lance-shaped bur  Dentaltix IT21517
Food maintenance diet Sodispain research ROD14 
Heated surgical platform PetSavers
Hollenback carver Hu-FRIEDY  HF45234
Hypodermic needle   BD  300600 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM
Isoflurane  Karizoo Isoflutek 1000mg/g
Ketamine   Dechra 581140.6 Anesketin 100 mg/mL
Lipopolysaccharide  derived from P.Gingivalis  InvivoGen TLRL-PGLPS
Methanol Fisher Scientific M/4000/PB08
Micro needle holter Fehling Surgical Instruments KOT-6
Microsurgical pliers KLS Martin 12-384-06-07
microsurgical scissors  S&T microsurgical instruments SDC-15 RV
Monitor iMEC 8 Vet Mindray 
Multiplex bead immunoassay Procartaplex, Thermo fisher Scientific PPX-05
Paraformaldehyde (PFA)  Sigma-Aldrich 8187151000
Periosteal microsurgical elevator  Dentaltix CU19112468
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)  Roche 10837091001
Phosphate Buffer Solution (PBS) Capricorn Scientific PBS-1A
PhosSTOP  Roche 4906845001 Commercial phosphatase inhibitor tablet 
Plastic vial SPL Lifesciencies 60015 1.5mL
Saline Cinfa 204024.3
Stereo Microscope  Zeiss Model SteREO Discovery.V12
Surgical loupes led light Zeiss
Surgical scissors  Zepf Surgical 08-1701-17
Syringe  BD plastipak 303172 1mL
Veterinary dental micromotor Eickemeyer 174028
Xylazine Calier 20102-003 Xilagesic 20 mg/mL

References

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Cite This Article
Munar-Bestard, M., Villa, O., Ferrà-Cañellas, M. d. M., Ramis, J. M., Monjo, M. Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model. J. Vis. Exp. (192), e64842, doi:10.3791/64842 (2023).

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