İnsan Foliküllerinde Gen İfade Analizleri
Summary
Burada, gen ekspresyon analizleri yapmak için insan yumurtalık foliküllerinin dondurulmuş-çözülmüş kortikal dokudan nasıl izole edileceğini özetleyen bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Yumurtalık, farklı hücre tiplerinden oluşan heterojen bir organdır. Folikülogenez sırasında meydana gelen moleküler mekanizmaları incelemek için, proteinlerin lokalizasyonu ve gen ekspresyonu sabit doku üzerinde gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bir insan folikülündeki gen ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için, bu karmaşık ve hassas yapı izole edilmelidir. Bu nedenle, Woodruff’un laboratuvarı tarafından daha önce tarif edilen uyarlanmış bir protokol, folikülleri (oosit ve granüloza hücreleri) çevrelerinden ayırmak için geliştirilmiştir. Yumurtalık kortikal dokusu ilk önce iki araç kullanılarak küçük parçalar elde etmek için manuel olarak işlenir: bir doku dilimleyici ve bir doku doğrayıcı. Doku daha sonra en az 40 dakika boyunca% 0.2 kollajenaz ve% 0.02 DNaz ile enzimatik olarak sindirilir. Bu çürütme adımı 37 °C ve %5 CO2’de gerçekleştirilir ve her 10 dakikada bir ortamın mekanik pipetlenmesi eşlik eder. İnkübasyondan sonra, izole edilmiş foliküller, mikroskop büyütme altında kalibre edilmiş bir mikrokapiller pipet kullanılarak manuel olarak toplanır. Doku parçalarında foliküller hala mevcutsa, prosedür manuel mikrodiseksiyon ile tamamlanır. Foliküller bir kültür ortamında buz üzerinde toplanır ve fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi damlacıkları içinde iki kez durulanır. Bu sindirim prosedürü, folikül bozulmasını önlemek için dikkatlice kontrol edilmelidir. Foliküllerin yapısı tehlikeye girer girmez veya maksimum 90 dakika sonra, reaksiyon% 10 fetal sığır serumu içeren 4 ° C’lik bir bloke edici çözelti ile durdurulur. Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) için RNA ekstraksiyonundan sonra yeterli miktarda toplam RNA elde etmek için en az 20 izole folikül (75 μm’nin altında boyutlu) toplanmalıdır. Ekstraksiyondan sonra, 20 folikülden toplam RNA’nın miktarının belirlenmesi ortalama 5 ng / μL’lik bir değere ulaşır. Toplam RNA daha sonra cDNA’ya retrokribe edilir ve ilgilenilen genler RT-qPCR kullanılarak daha fazla analiz edilir.
Introduction
Yumurtalık, korteks ve stroma içindeki foliküller de dahil olmak üzere fonksiyonel ve yapısal birimlerden oluşan karmaşık bir organdır. Folikülogenez, folikül aktivasyonu, büyümesi ve olgunlaşması süreci, ilkel sessiz bir durumdan döllenebilen ve erken embriyonik gelişimi destekleyen olgun bir foliküle kadar, araştırma1’de yaygın olarak incelenmiştir. Bu fenomeni yönlendiren mekanizmaların çözülmesi, kadınlar için doğurganlık bakımını iyileştirebilir2. Sabit insan dokusu üzerinde yapılan analizler, yumurtalığın fonksiyonel birimleri içinde protein ekspresyonunun ve gen lokalizasyonunun değerlendirilmesine izin verir 3,4. Bununla birlikte, yumurtalık folikülleri içindeki gen ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için folikülleri çevreleyen korteksten ayırmak için spesifik tekniklere ihtiyaç vardır. Bu nedenle, önceki bir çalışmada, gen ekspresyonunun doğrudan yumurtalık fonksiyonel biriminden analiz edilmesine izin vermek için bir folikül izolasyon tekniği geliştirilmiştir5. Enzimatik sindirim ve / veya mekanik izolasyonun yanı sıra lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi, bir doku parçası 6,7,8,9 içinde folikül izolasyonuna izin veren farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Folikül izolasyonu, gelişimin her aşamasında foliküllerin gen ekspresyon profillerini değerlendirmek için insan veya hayvan yumurtalık dokusu ile yaygın olarak kullanılmaktadır10,11,12. Bununla birlikte, optimal bir izolasyon prosedürü, folikülün yoğun korteks içindeki kırılgan yapısını dikkate almalı ve bu nedenle herhangi bir hasarı önlemek için dikkatle yapılmalıdır7. Bu makale, Woodruff’un laboratuvarı tarafından tanımlanan bir protokolden uyarlanmış, gen ekspresyon analizleri yapmak için insan foliküllerini dondurulmuş-çözülmüş yumurtalık korteksinden izole etmek için bir prosedürü açıklamaktadır13.
Dondurulmuş insan dokusundan yumurtalık folikülü izolasyonunun ilk adımı çözme işlemidir. Bu işlem, daha önce tarif edildiği gibi, kriyokorunmuş yumurtalık dokusunun greftlenmesi için kullanılan klinik protokole dayanarak gerçekleştirilir14,15. İşlem, ortamın azalan konsantrasyonlarında yumurtalık korteksi durulayarak kriyoprotektan ajanların uzaklaştırılmasını amaçlamaktadır. Daha sonra, folikülleri almak için enzimatik ve mekanik izolasyondan önce doku parçalanır. Farklı aşamalardaki foliküller, ilgilenenleri izole etmek için yüksek büyütmeli ve kaliteli optiklere sahip bir stereomikroskop kullanılarak ayırt edilebilir. İzole edilen her folikül, mikroskopa entegre edilmiş bir cetvel kullanılarak ölçülür ve foliküller gelişim aşamalarına göre toplanabilir: ilkel foliküller (30 μm), birincil foliküller (60 μm), ikincil foliküller (120-200 μm) ve antral foliküller (>200 μm)16. Foliküllerin morfolojisine göre daha ileri sınıflandırma yapılabilir: primordiyal foliküller bir kat düzleştirilmiş granüloza hücresine (GC) sahiptir, primer foliküller bir kat küboidal GC’ye sahiptir, ikincil foliküller en az iki kat küboidal GC’ye sahiptir ve GC’ler arasında bir boşluğun varlığı antral aşamayı karakterize eder. İlgilenilen foliküller seçildiğinde, RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilir. RNA miktarı ve kalitesi, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonundan (RT-qPCR) önce değerlendirilir (Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Yumurtalık dokusunun kriyoprezervasyonu, kanser hastalarının fertilitesini korumak için umut verici bir yaklaşımdır. Klinikte, çözülmüş kortikal doku remisyon sonrası hastaya tekrar aşılanır ve yumurtalık fonksiyonunun ve doğurganlığın yeniden başlamasına izin verir19,20. Klinik kullanımın yanı sıra, folikülogenezi düzenleyen mekanizmaları incelemek için depolama süresinin sonunda araştırma için artık yumurtalık fragmanları d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma bir Bilim Mükemmelliği (EOS) hibesi (ID: 30443682) ile desteklenmiştir. I.D. Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique’de (FNRS) yardımcı araştırmacıdır.
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d’Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -. L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
