Summary

Analyses de l’expression génique dans les follicules humains

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Ici, nous décrivons un protocole décrivant comment isoler les follicules ovariens humains du tissu cortical gelé-décongelé pour effectuer des analyses d’expression génique.

Abstract

L’ovaire est un organe hétérogène composé de différents types de cellules. Pour étudier les mécanismes moléculaires se produisant au cours de la folliculogenèse, la localisation des protéines et l’expression des gènes peuvent être effectuées sur des tissus fixes. Cependant, pour évaluer correctement les niveaux d’expression génique dans un follicule humain, cette structure complexe et délicate doit être isolée. Par conséquent, un protocole adapté précédemment décrit par le laboratoire de Woodruff a été développé pour séparer les follicules (l’ovocyte et les cellules de la granulosa) de leur environnement. Le tissu cortical ovarien est d’abord traité manuellement pour obtenir de petits fragments à l’aide de deux outils: une trancheuse de tissu et un hachoir à tissus. Le tissu est ensuite digéré enzymatiquement avec 0,2% de collagénase et 0,02% de DNase pendant au moins 40 min. Cette étape de digestion est réalisée à 37 °C et 5% de CO2 et s’accompagne d’un pipetage mécanique du milieu toutes les 10 min. Après incubation, les follicules isolés sont collectés manuellement à l’aide d’une pipette microcapillaire calibrée sous grossissement au microscope. Si les follicules sont toujours présents dans les morceaux de tissu, la procédure est complétée par une microdissection manuelle. Les follicules sont recueillis sur de la glace dans un milieu de culture et sont rincés deux fois dans des gouttelettes de solution saline tamponnée au phosphate. Cette procédure de digestion doit être soigneusement contrôlée pour éviter la détérioration du follicule. Dès que la structure des follicules semble compromise ou après un maximum de 90 min, la réaction est arrêtée avec une solution bloquante à 4 °C contenant 10% de sérum bovin fœtal. Un minimum de 20 follicules isolés (de moins de 75 μm) doit être recueilli pour obtenir une quantité adéquate d’ARN total après extraction de l’ARN pour la réaction en chaîne quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR). Après extraction, la quantification de l’ARN total de 20 follicules atteint une valeur moyenne de 5 ng/μL. L’ARN total est ensuite rétrotranscrit en ADNc, et les gènes d’intérêt sont analysés plus en détail à l’aide de la RT-qPCR.

Introduction

L’ovaire est un organe complexe composé d’unités fonctionnelles et structurelles, y compris les follicules dans le cortex et le stroma. La folliculométrie, le processus d’activation, de croissance et de maturation des follicules d’un état de repos primordial à un follicule mature capable d’être fécondé et de soutenir le développement embryonnaire précoce, est largement étudiée dans la recherche1. Démêler les mécanismes à l’origine de ce phénomène pourrait améliorer les soins de fertilité pour les femmes2. Les analyses sur tissus humains fixes permettent d’évaluer l’expression des protéines et la localisation des gènes au sein des unités fonctionnelles de l’ovaire 3,4. Cependant, des techniques spécifiques sont nécessaires pour dissocier les follicules du cortex environnant afin d’évaluer avec précision les niveaux d’expression génique dans les follicules ovariens. Ainsi, dans une étude précédente, une technique d’isolement des follicules a été développée pour permettre des analyses de l’expression génique directement à partir de l’unité fonctionnelle de l’ovaire5. Différentes approches ont été développées, telles que la digestion enzymatique et/ou l’isolation mécanique, ainsi que la microdissection par capture laser, qui permettent l’isolation du follicule dans un morceau de tissu 6,7,8,9. L’isolement des follicules est largement utilisé, que ce soit avec du tissu ovarien humain ou animal, pour évaluer les profils d’expression génique des follicules à tous les stades de développement10,11,12. Cependant, une procédure d’isolement optimale doit tenir compte de la structure fragile du follicule dans le cortex dense et, par conséquent, doit être effectuée avec soin pour éviter tout dommage7. Ce manuscrit décrit une procédure, adaptée d’un protocole décrit par le laboratoire de Woodruff, pour isoler des follicules humains du cortex ovarien gelé-décongelé afin d’effectuer des analyses d’expression génique13.

La première étape de l’isolement du follicule ovarien à partir de tissus humains congelés est la procédure de décongélation. Ce processus est réalisé sur la base du protocole clinique utilisé pour la greffe de tissu ovarien cryoconservé, tel que décrit précédemment14,15. Le procédé vise à éliminer les agents cryoprotecteurs en rinçant le cortex ovarien à des concentrations décroissantes du milieu. Ensuite, le tissu est fragmenté avant isolement enzymatique et mécanique pour récupérer les follicules. Les follicules à différents stades peuvent être distingués à l’aide d’un stéréomicroscope à fort grossissement et à optique de bonne qualité afin d’isoler ceux qui vous intéressent. Chaque follicule isolé est mesuré à l’aide d’une règle intégrée au microscope, et les follicules peuvent être regroupés en fonction de leur stade de développement : follicules primordiaux (30 μm), follicules primaires (60 μm), follicules secondaires (120-200 μm) et follicules antraux (>200 μm)16. Une classification plus poussée peut être effectuée en fonction de la morphologie des follicules: les follicules primordiaux ont une couche de cellules granulosa aplaties (GC), les follicules primaires ont une couche de GC cuboïdes, les follicules secondaires ont au moins deux couches de GC cuboïdes et la présence d’une cavité parmi les GC caractérise le stade antral. Lorsque les follicules d’intérêt sont sélectionnés, une extraction d’ARN est effectuée. La quantité et la qualité de l’ARN sont évaluées avant la réaction quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR) (Figure 1).

Protocol

Ce projet a été approuvé par le Comité d’éthique de l’hôpital Erasme (Bruxelles, Belgique). La patiente incluse dans ce protocole a subi une cryoconservation du tissu ovarien (OTC) pour la préservation de la fertilité avant l’exposition à la chimiothérapie en 2000. La patiente a signé un consentement écrit éclairé pour faire don de ses tissus congelés résiduels à la recherche à la fin de la période d’entreposage. 1. Décongélation du tissu ovarien cryoconserv?…

Representative Results

En utilisant cette procédure d’isolement, l’expérimentateur peut récupérer des follicules de l’environnement stromal pour effectuer des analyses d’expression génique spécifiques. En fonction de la taille et de la morphologie des follicules, il est possible de différencier les différentes étapes de la folliculogenèse. L’expérimentateur peut sélectionner les follicules d’intérêt en fonction de leur taille à l’aide d’une pipette microcapillaire adaptée. En utilisant un microcapillaire de 75 ?…

Discussion

La cryoconservation du tissu ovarien est une approche prometteuse pour préserver la fertilité des patientes atteintes de cancer. En clinique, le tissu cortical décongelé est greffé à la patiente après la rémission, permettant la reprise de la fonction ovarienne et de la fertilité19,20. Outre l’utilisation clinique, des fragments ovariens résiduels peuvent également être donnés pour la recherche à la fin de la période de stockage afin d’étudier…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention d’excellence scientifique (EOS) (ID: 30443682). I.D. est chercheur associé au Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Materials

2 mm gridded Petri dish Corning 430196
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
2100 Expert software Agilent version B.02.08.SI648
4-wells plate Sigma Aldrich D6789
6-wells plate Carl Roth  EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kit Agilent 5067-1513
Ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes Sigma Aldrich A5177
Centrifuge Eppendorf 5424R
Collagenase IV LifeTechnologies 17104-019
DMSO Sigma Aldrich D2650
DNase Sigma Aldrich D4527-10kU
FBS Gibco 10270-106
GoScript reverse transcriptase Promega A5003
HSA CAF DCF  LC4403-41-080
Leibovitz-15 LifeTechnologies 11415-049
L-Glutamine Sigma Aldrich G7513
McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes LifeTechnologies 12330-031
McIlwain tissue chopper Stoelting 51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm CooperSurgical 7-72-2200/1
Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm CooperSurgical 7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c operating software ThermoFisher version 1.6
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher 2000/2000c
Penicillin G Sigma Aldrich P3032
PowerTrack SYBR green master mix ThermoFisher A46109
Primers: GDF9 F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primers: HPRT F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primers: Kit Ligand F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3 ThermoFisher A33779
RNAqueous-micro total RNA isolation kit ThermoFisher AM1931
Selenium Sigma Aldrich S9133
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636
Stereomicroscope Nikon SMZ800
Streptomycine sulfate Sigma Aldrich S1277
Sucrose Sigma Aldrich S1888
Thermo Scientific Forma Series II  water-jacketed CO2 incubators ThermoFisher 3110
Thomas Stadie-Riggs tissue slicer Thomas Scientific 6727C10
Transferrin Roche  10652202001

References

  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d’Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
  3. Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
  4. Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
  5. Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
  6. Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
  7. Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
  8. Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
  9. Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
  10. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
  11. McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
  12. Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
  13. Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
  14. Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
  15. Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
  16. Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
  17. Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
  18. Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
  19. Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
  20. Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
  21. Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
  22. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
  23. Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
  24. Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
  25. Dong, F. -. L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
  26. Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
  27. Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
  28. Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
  29. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  30. Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
  31. Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
  32. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).

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Cite This Article
Devos, M., Dias Nunes, J., Demeestere, I. Gene Expression Analyses in Human Follicles. J. Vis. Exp. (192), e64807, doi:10.3791/64807 (2023).

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