Summary

Genexpressieanalyses in menselijke follikels

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Hier beschrijven we een protocol dat beschrijft hoe menselijke ovariële follikels kunnen worden geïsoleerd uit bevroren ontdooid corticale weefsel om genexpressieanalyses uit te voeren.

Abstract

De eierstok is een heterogeen orgaan dat bestaat uit verschillende celtypen. Om de moleculaire mechanismen te bestuderen die optreden tijdens folliculogenese, kan de lokalisatie van eiwitten en genexpressie worden uitgevoerd op vast weefsel. Om de genexpressieniveaus in een menselijke follikel goed te kunnen beoordelen, moet deze complexe en delicate structuur echter worden geïsoleerd. Daarom is een aangepast protocol ontwikkeld dat eerder door het laboratorium van Woodruff is beschreven om follikels (de eicel en de granulosacellen) te scheiden van hun omgeving. Het eierstokschorsweefsel wordt eerst handmatig verwerkt om kleine fragmenten te verkrijgen met behulp van twee hulpmiddelen: een weefselsnijder en een weefselhakselaar. Het weefsel wordt vervolgens enzymatisch verteerd met 0,2% collagenase en 0,02% DNase gedurende ten minste 40 minuten. Deze verteringsstap wordt uitgevoerd bij 37 °C en 5% CO2 en gaat gepaard met mechanisch pipetteren van het medium om de 10 min. Na incubatie worden de geïsoleerde follikels handmatig verzameld met behulp van een gekalibreerde microcapillaire pipet onder microscoopvergroting. Als er nog follikels aanwezig zijn in de stukjes weefsel, wordt de procedure voltooid met handmatige microdissectie. De follikels worden verzameld op ijs in een kweekmedium en worden tweemaal gespoeld in druppeltjes fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Deze verteringsprocedure moet zorgvuldig worden gecontroleerd om verslechtering van de follikel te voorkomen. Zodra de structuur van de follikels aangetast lijkt te zijn of na maximaal 90 min, wordt de reactie gestopt met een 4 °C blokkerende oplossing die 10% foetaal runderserum bevat. Een minimum van 20 geïsoleerde follikels (kleiner dan 75 μm) moet worden verzameld om een voldoende hoeveelheid totaal RNA te verkrijgen na RNA-extractie voor real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Na extractie bereikt de kwantificering van totaal RNA uit 20 follikels een gemiddelde waarde van 5 ng/μL. Het totale RNA wordt vervolgens achteraf getranscribeerd in cDNA en de genen van belang worden verder geanalyseerd met behulp van RT-qPCR.

Introduction

De eierstok is een complex orgaan dat bestaat uit functionele en structurele eenheden, waaronder de follikels in de cortex en het stroma. Folliculogenese, het proces van follikelactivering, groei en rijping van een primordiale rusttoestand naar een volwassen follikel die kan worden bevrucht en om de vroege embryonale ontwikkeling te ondersteunen, wordt op grote schaal bestudeerd in onderzoek1. Het ontrafelen van de mechanismen die dit fenomeen veroorzaken, zou de vruchtbaarheidszorg voor vrouwenkunnen verbeteren 2. Analyses op vast menselijk weefsel maken de beoordeling van eiwitexpressie en genlokalisatie binnen de functionele eenheden van de eierstokmogelijk 3,4. Er zijn echter specifieke technieken nodig om de follikels te dissociëren van de omliggende cortex om de genexpressieniveaus in de ovariële follikels nauwkeurig te beoordelen. Daarom werd in een eerdere studie een follikelisolatietechniek ontwikkeld om analyses van genexpressie rechtstreeks vanuit de functionele eenheid van de eierstok5 mogelijk te maken. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld, zoals enzymatische spijsvertering en / of mechanische isolatie, evenals laservangstmicrodissectie, die follikelisolatie in eenstuk weefsel 6,7,8,9 mogelijk maken. Follikelisolatie wordt veel gebruikt, hetzij met menselijk of dierlijk eierstokweefsel, om de genexpressieprofielen van follikels in alle stadia van ontwikkeling te evalueren10,11,12. Een optimale isolatieprocedure moet echter rekening houden met de fragiele structuur van de follikel in de dichte cortex en moet daarom met zorg worden uitgevoerd om schade te voorkomen7. Dit manuscript beschrijft een procedure, aangepast van een protocol beschreven door Woodruff’s laboratorium, om menselijke follikels te isoleren uit bevroren ontdooide ovariële cortex om genexpressieanalyses uit te voeren13.

De eerste stap van ovariële follikelisolatie van bevroren menselijk weefsel is de ontdooiingsprocedure. Dit proces wordt uitgevoerd op basis van het klinische protocol dat wordt gebruikt voor het enten van gecryopreserveerd ovariumweefsel, zoals eerder beschreven14,15. Het proces is gericht op het verwijderen van de cryoprotectieve middelen door de ovariële cortex te spoelen in afnemende concentraties van het medium. Vervolgens wordt het weefsel gefragmenteerd voordat enzymatische en mechanische isolatie plaatsvindt om de follikels op te halen. Follikels in verschillende stadia kunnen worden onderscheiden met behulp van een stereomicroscoop met hoge vergroting en optica van goede kwaliteit om de interessante te isoleren. Elke geïsoleerde follikel wordt gemeten met behulp van een liniaal geïntegreerd in de microscoop, en de follikels kunnen worden samengevoegd volgens hun ontwikkelingsstadium: primordiale follikels (30 μm), primaire follikels (60 μm), secundaire follikels (120-200 μm) en antrale follikels (>200 μm)16. Verdere classificatie kan worden uitgevoerd volgens de morfologie van de follikels: primordiale follikels hebben één laag afgeplatte granulosacellen (GC’s), primaire follikels hebben één laag kubusvormige GC’s, secundaire follikels hebben ten minste twee lagen kuboïdale GC’s en de aanwezigheid van een holte tussen de GC’s kenmerkt het antrale stadium. Wanneer follikels van belang worden geselecteerd, wordt RNA-extractie uitgevoerd. De hoeveelheid en kwaliteit van RNA worden geëvalueerd voorafgaand aan de real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) (figuur 1).

Protocol

Dit project werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Erasme Ziekenhuis (Brussel, België). De patiënt die in dit protocol was opgenomen, onderging cryopreservatie van ovariumweefsel (OTC) voor vruchtbaarheidsbehoud vóór blootstelling aan chemotherapie in 2000. De patiënte tekende schriftelijke toestemming om haar resterende ingevroren weefsel aan het einde van de bewaartermijn te doneren aan onderzoek. 1. Ontdooien van gecryopreserveerd eierstokweefsel <li…

Representative Results

Met behulp van deze isolatieprocedure kan de experimentator follikels uit de stromale omgeving halen om specifieke genexpressieanalyses uit te voeren. Op basis van de grootte en morfologie van de follikels is het mogelijk om de verschillende stadia van folliculogenese te onderscheiden. De experimentator kan follikels van belang selecteren op basis van hun grootte met behulp van een aangepaste microcapillaire pipet. Door een microcapillair van maximaal 75 μm te gebruiken, is het mogelijk om primordiale en primaire follik…

Discussion

De cryopreservatie van eierstokweefsel is een veelbelovende aanpak voor het behoud van de vruchtbaarheid van kankerpatiënten. In de kliniek wordt ontdooid corticale weefsel na remissie terug in de patiënt geënt, waardoor de ovariële functie en vruchtbaarheid kunnen worden hervat19,20. Naast klinisch gebruik kunnen resterende ovariumfragmenten ook worden gedoneerd voor onderzoek aan het einde van de opslagperiode om de mechanismen te bestuderen die folliculoge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een Excellence of Science (EOS) beurs (ID: 30443682). I.D. is associate researcher bij het Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Materials

2 mm gridded Petri dish Corning 430196
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
2100 Expert software Agilent version B.02.08.SI648
4-wells plate Sigma Aldrich D6789
6-wells plate Carl Roth  EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kit Agilent 5067-1513
Ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes Sigma Aldrich A5177
Centrifuge Eppendorf 5424R
Collagenase IV LifeTechnologies 17104-019
DMSO Sigma Aldrich D2650
DNase Sigma Aldrich D4527-10kU
FBS Gibco 10270-106
GoScript reverse transcriptase Promega A5003
HSA CAF DCF  LC4403-41-080
Leibovitz-15 LifeTechnologies 11415-049
L-Glutamine Sigma Aldrich G7513
McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes LifeTechnologies 12330-031
McIlwain tissue chopper Stoelting 51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm CooperSurgical 7-72-2200/1
Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm CooperSurgical 7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c operating software ThermoFisher version 1.6
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher 2000/2000c
Penicillin G Sigma Aldrich P3032
PowerTrack SYBR green master mix ThermoFisher A46109
Primers: GDF9 F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primers: HPRT F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primers: Kit Ligand F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3 ThermoFisher A33779
RNAqueous-micro total RNA isolation kit ThermoFisher AM1931
Selenium Sigma Aldrich S9133
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636
Stereomicroscope Nikon SMZ800
Streptomycine sulfate Sigma Aldrich S1277
Sucrose Sigma Aldrich S1888
Thermo Scientific Forma Series II  water-jacketed CO2 incubators ThermoFisher 3110
Thomas Stadie-Riggs tissue slicer Thomas Scientific 6727C10
Transferrin Roche  10652202001

References

  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d’Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
  3. Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
  4. Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
  5. Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
  6. Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
  7. Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
  8. Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
  9. Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
  10. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
  11. McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
  12. Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
  13. Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
  14. Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
  15. Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
  16. Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
  17. Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
  18. Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
  19. Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
  20. Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
  21. Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
  22. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
  23. Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
  24. Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
  25. Dong, F. -. L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
  26. Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
  27. Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
  28. Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
  29. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  30. Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
  31. Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
  32. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).

Play Video

Cite This Article
Devos, M., Dias Nunes, J., Demeestere, I. Gene Expression Analyses in Human Follicles. J. Vis. Exp. (192), e64807, doi:10.3791/64807 (2023).

View Video