Summary

تحليلات التعبير الجيني في البصيلات البشرية

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا يحدد كيفية عزل بصيلات المبيض البشرية عن الأنسجة القشرية المذابة المجمدة لإجراء تحليلات التعبير الجيني.

Abstract

المبيض هو عضو غير متجانس يتكون من أنواع مختلفة من الخلايا. لدراسة الآليات الجزيئية التي تحدث أثناء تكوين الجريب ، يمكن إجراء توطين البروتينات والتعبير الجيني على الأنسجة الثابتة. ومع ذلك ، لتقييم مستويات التعبير الجيني بشكل صحيح في جريب بشري ، يجب عزل هذا الهيكل المعقد والدقيق. ومن ثم ، تم تطوير بروتوكول معدل سبق وصفه من قبل مختبر وودروف لفصل البصيلات (البويضة والخلايا الحبيبية) عن البيئة المحيطة بها. تتم معالجة الأنسجة القشرية المبيضية يدويا أولا للحصول على شظايا صغيرة باستخدام أداتين: قطاعة الأنسجة ومفرمة الأنسجة. ثم يتم هضم الأنسجة إنزيميا مع 0.2 ٪ كولاجيناز و 0.02 ٪ DNase لمدة 40 دقيقة على الأقل. يتم تنفيذ خطوة الهضم هذه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ويرافقها ماصة ميكانيكية للوسط كل 10 دقائق. بعد الحضانة ، يتم جمع البصيلات المعزولة يدويا باستخدام ماصة شعرية دقيقة معايرة تحت تكبير المجهر. إذا كانت البصيلات لا تزال موجودة في قطع الأنسجة ، يتم الانتهاء من الإجراء بالتشريح المجهري اليدوي. يتم جمع البصيلات على الجليد في وسط استزراع ويتم شطفها مرتين في قطرات من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يجب التحكم في عملية الهضم هذه بعناية لتجنب تدهور الجريب. بمجرد أن يبدو أن بنية البصيلات معرضة للخطر أو بعد 90 دقيقة كحد أقصى ، يتم إيقاف التفاعل بمحلول مانع 4 درجات مئوية يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. يجب جمع ما لا يقل عن 20 جريبا معزولا (بحجم أقل من 75 ميكرومتر) للحصول على كمية كافية من إجمالي الحمض النووي الريبي بعد استخراج الحمض النووي الريبي لتفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-qPCR). بعد الاستخراج ، يصل القياس الكمي للحمض النووي الريبي الكلي من 20 بصيلة إلى قيمة متوسطة تبلغ 5 نانوغرام / ميكرولتر. ثم يتم نسخ الحمض النووي الريبي الكلي إلى cDNA ، ويتم تحليل الجينات ذات الأهمية باستخدام RT-qPCR.

Introduction

المبيض هو عضو معقد يتكون من وحدات وظيفية وهيكلية ، بما في ذلك البصيلات داخل القشرة والسدى. تمت دراسة الجريب ، وهي عملية تنشيط الجريب والنمو والنضج من حالة هادئة بدائية إلى جريب ناضج قادر على الإخصاب ودعم التطور الجنيني المبكر ، على نطاق واسع في البحث1. يمكن أن يؤدي كشف الآليات التي تقود هذه الظاهرة إلى تحسين رعاية الخصوبة للنساء2. تسمح التحليلات على الأنسجة البشرية الثابتة بتقييم التعبير البروتيني وتوطين الجينات داخل الوحدات الوظيفية للمبيض 3,4. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تقنيات محددة لفصل البصيلات عن القشرة المحيطة لتقييم مستويات التعبير الجيني بدقة داخل بصيلات المبيض. ومن ثم ، في دراسة سابقة ، تم تطوير تقنية عزل الجريب للسماح بتحليل التعبير الجيني مباشرة من الوحدة الوظيفية للمبيض5. تم تطوير طرق مختلفة ، مثل الهضم الأنزيمي و / أو العزل الميكانيكي ، بالإضافة إلى التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، والذي يسمح بعزل الجريب داخل قطعة من الأنسجة6،7،8،9. يستخدم عزل الجريب على نطاق واسع ، إما مع أنسجة المبيض البشرية أو الحيوانية ، لتقييم ملامح التعبير الجيني للجريبات في جميع مراحل التطور10،11،12. ومع ذلك ، يجب أن يأخذ إجراء العزل الأمثل في الاعتبار البنية الهشة للجريب داخل القشرة الكثيفة ، وبالتالي ، يجب إجراؤه بعناية لتجنب أي ضرر7. تصف هذه المخطوطة إجراء، مقتبسا من بروتوكول وصفه مختبر وودروف، لعزل البصيلات البشرية عن قشرة المبيض المذابة المجمدة من أجل إجراء تحليلات التعبير الجيني13.

الخطوة الأولى لعزل جريب المبيض من الأنسجة البشرية المجمدة هي إجراء الذوبان. يتم تنفيذ هذه العملية بناء على البروتوكول السريري المستخدم لتطعيم أنسجة المبيض المحفوظة بالتبريد ، كما هو موضح سابقا14،15. تهدف العملية إلى إزالة العوامل الواقية من البرودة عن طريق شطف قشرة المبيض بتركيزات متناقصة من الوسط. ثم يتم تفتيت الأنسجة قبل العزل الأنزيمي والميكانيكي لاسترداد البصيلات. يمكن تمييز البصيلات في مراحل مختلفة باستخدام مجهر مجسم ذو تكبير عالي وبصريات عالية الجودة من أجل عزل تلك ذات الأهمية. يتم قياس كل جريب معزول باستخدام مسطرة مدمجة في المجهر ، ويمكن تجميع البصيلات وفقا لمرحلة نموها: بصيلات بدائية (30 ميكرومتر) ، بصيلات أولية (60 ميكرومتر) ، بصيلات ثانوية (120-200 ميكرومتر) ، وجريبات غارية (>200 ميكرومتر) 16. يمكن إجراء مزيد من التصنيف وفقا لمورفولوجيا البصيلات: تحتوي البصيلات البدائية على طبقة واحدة من الخلايا الحبيبية المسطحة (GCs) ، وتحتوي البصيلات الأولية على طبقة واحدة من GCs المكعبة ، وتحتوي البصيلات الثانوية على طبقتين على الأقل من GCs المكعبة ، ووجود تجويف بين GCs يميز المرحلة الغارية. عندما يتم اختيار بصيلات الاهتمام ، يتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي. يتم تقييم كمية وجودة الحمض النووي الريبي قبل تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-qPCR) (الشكل 1).

Protocol

تمت الموافقة على هذا المشروع من قبل اللجنة الأخلاقية لمستشفى Erasme (بروكسل ، بلجيكا). خضعت المريضة المشمولة بهذا البروتوكول لحفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) للحفاظ على الخصوبة قبل التعرض للعلاج الكيميائي في عام 2000. وقعت المريضة موافقة خطية مستنيرة للتبرع بأنسجتها المجمدة المتبقية للبحث في نه…

Representative Results

باستخدام إجراء العزل هذا ، يمكن للمجرب استرداد البصيلات من البيئة اللحمية لإجراء تحليلات محددة للتعبير الجيني. بناء على حجم ومورفولوجيا البصيلات ، من الممكن التمييز بين المراحل المختلفة لتكوين الجريبات. يمكن للمجرب اختيار بصيلات ذات أهمية وفقا لحجمها باستخدام ماصة شعرية دقيقة مكيفة. با?…

Discussion

يعد الحفظ بالتبريد لأنسجة المبيض نهجا واعدا للحفاظ على خصوبة مرضى السرطان. في العيادة ، يتم تطعيم الأنسجة القشرية المذابة مرة أخرى في المريض بعد مغفرة ، مما يسمح باستئناف وظيفة المبيض والخصوبة19,20. إلى جانب الاستخدام السريري ، يمكن أيضا التبرع بشظايا المبيض…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة التميز العلمي (EOS) (ID: 30443682). دكتوراه باحثة مشاركة في الصندوق الوطني للبحوث العلمية البلجيكية (FNRS).

Materials

2 mm gridded Petri dish Corning 430196
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
2100 Expert software Agilent version B.02.08.SI648
4-wells plate Sigma Aldrich D6789
6-wells plate Carl Roth  EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kit Agilent 5067-1513
Ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes Sigma Aldrich A5177
Centrifuge Eppendorf 5424R
Collagenase IV LifeTechnologies 17104-019
DMSO Sigma Aldrich D2650
DNase Sigma Aldrich D4527-10kU
FBS Gibco 10270-106
GoScript reverse transcriptase Promega A5003
HSA CAF DCF  LC4403-41-080
Leibovitz-15 LifeTechnologies 11415-049
L-Glutamine Sigma Aldrich G7513
McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes LifeTechnologies 12330-031
McIlwain tissue chopper Stoelting 51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm CooperSurgical 7-72-2200/1
Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm CooperSurgical 7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c operating software ThermoFisher version 1.6
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher 2000/2000c
Penicillin G Sigma Aldrich P3032
PowerTrack SYBR green master mix ThermoFisher A46109
Primers: GDF9 F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primers: HPRT F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primers: Kit Ligand F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3 ThermoFisher A33779
RNAqueous-micro total RNA isolation kit ThermoFisher AM1931
Selenium Sigma Aldrich S9133
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636
Stereomicroscope Nikon SMZ800
Streptomycine sulfate Sigma Aldrich S1277
Sucrose Sigma Aldrich S1888
Thermo Scientific Forma Series II  water-jacketed CO2 incubators ThermoFisher 3110
Thomas Stadie-Riggs tissue slicer Thomas Scientific 6727C10
Transferrin Roche  10652202001

References

  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d’Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
  3. Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
  4. Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
  5. Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
  6. Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
  7. Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
  8. Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
  9. Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
  10. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
  11. McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
  12. Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
  13. Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
  14. Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
  15. Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
  16. Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
  17. Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
  18. Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
  19. Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
  20. Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
  21. Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
  22. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
  23. Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
  24. Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
  25. Dong, F. -. L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
  26. Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
  27. Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
  28. Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
  29. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  30. Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
  31. Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
  32. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).

Play Video

Cite This Article
Devos, M., Dias Nunes, J., Demeestere, I. Gene Expression Analyses in Human Follicles. J. Vis. Exp. (192), e64807, doi:10.3791/64807 (2023).

View Video