マイクロバブルを用いたヒト末梢血単核細胞サンプルからの浮遊選鉱ベースのT細胞の単離、活性化、および増殖(英語)
Summary
この研究の目的は、初代ヒトT細胞を単離、活性化、および増殖させるための浮遊選鉱ベースの分離の実現可能性を実証することです。
Abstract
末梢血単核細胞(PBMC)からT細胞を単離して ex vivo 培養を確立するプロセスは、研究、臨床試験、および細胞ベースの治療にとって非常に重要です。この研究では、PBMCからT細胞を ex vivo で分離、活性化、および拡張するための簡単で新しいプロトコルが提示されます。この研究では、機能化された浮力活性化セルソーティング(BACS)技術を利用して、T細胞を分離および活性化します。簡単に言うと、このプロトコルには、ロイコパック由来のPBMCからのCD3+ 細胞のポジティブ選択と、それに続く24ウェルプレートへの形質導入前の、事前に結合した抗CD28結合ストレプトアビジンマイクロバブル(SAMB)による48時間の共刺激が含まれます。機能化されたマイクロバブルは、細胞を浮力的に活性化するユニークな機会を提供し、最小限の消耗で増殖を可能にする増殖表現型につながります。この技術は、共刺激マイクロバブルが浮力を維持し、培養培地の上部に戻るため、枯渇を低減し、膨張細胞が共刺激因子と接触する時間を短縮します。結果は、単離および培養されたT細胞が活性化および増殖するのに十分な刺激を受けるが、過剰なPD-1の存在によって実証されるように、過剰活性化につながる程度ではなく、その後枯渇につながることを示している。
Introduction
現在、世界中で500を超えるキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞療法の臨床試験が実施されており、4つのCAR-T細胞療法製品が市場で入手可能です1。しかし、これらの潜在的に治癒的治療法の有効性、スケーラビリティ、および長期的な成功を改善するために対処しなければならない多くのCAR-T細胞研究および製造ニーズが依然として存在します2、3、4、5。養子CAR-T細胞の臨床研究と製造は、末梢血サンプルからのT細胞の単離と、その後の単離細胞の刺激、形質導入、および増殖から始まります。T細胞の回収率、純度、活性化/枯渇シグナルなどのパラメータは、CAR-T細胞の研究および製造のための細胞単離および刺激技術を選択する際に慎重に検討する必要があります3,4,6。重要なことに、治療効果を高めるためには、T細胞枯渇などの現在の製造プロセスから生じる生物学的障害を最小限に抑えることによるCAR-T細胞療法の治療持続性の改善が必要である6,7。
ここでは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)や磁気活性化セルソーティング(MACS)などの従来の細胞単離法に代わるものとして、T細胞単離用のマイクロバブルを用いた浮力活性化セルソーティング(BACS)が実証されています。マイクロバブル分離は、浮力のある中空の微小球状体(マイクロバブル)を使用してターゲットを結合し、それらを流体サンプルの表面に浮遊させます8,9。マイクロバブルを抗体(すなわち抗CD3)で機能化することにより、所望のT細胞集団を末梢血サンプルから積極的に選択することができる。続いて、懸濁液中の陽性に選択されたT細胞を共刺激および活性化するための抗体機能化マイクロバブル(すなわち、抗CD28)の異なる集団の使用が、この研究において実証されている。マイクロバブルは、浮遊細胞培養や遺伝子組み換えや増殖などのダウンストリームアプリケーションに対応したT細胞を生成する、シンプルで高度に調整可能な単離および活性化ワークフローを提供します。重要なことに、マイクロバブルによる浮力細胞活性化は、抑制された細胞刺激を促進し、過剰なT細胞の枯渇を防ぎます7。
この研究では、フローサイトメトリーは、機能化されたマイクロバブルの単離、活性化、形質導入の成功を分析し、形質導入後の成長段階と拡大段階に存在する特定の亜集団に関する詳細情報を提供するために使用された主要なツールでした。フローサイトメトリーに加えて、明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡を使用して、細胞の健康状態、形態、形質導入の成功を確認しました。これらの結果に基づいて、マイクロバブル技術とプロトコルは、現在使用されている従来の分離および活性化方法に代わる、より調整可能で穏やかな代替手段を提供します。特に、マイクロバブル活性化細胞は、業界標準のツールやキットで通常観察されるものよりも、T細胞枯渇マーカーの発現が著しく低いことを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたプロトコルは、PBMCサンプルからのT細胞の単離およびマイクロバブルを含む培地中の懸濁T細胞の活性化を可能にする。この方法は、その固有の浮力が細胞に共刺激シグナルを導入し、培養培地に懸濁している間にそれらを活性化するユニークな機会を提供する機能化されたマイクロバブルに依存しており、それによって拡大する細胞の長時間の刺激への曝露を低減します。このよ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
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