Summary

בידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מבוססי ציפה מדגימות תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים באמצעות מיקרו-בועות

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

מטרת מחקר זה היא להדגים את ההיתכנות של הפרדה מבוססת ציפה כדי לבודד, להפעיל ולהרחיב תאי T אנושיים ראשוניים.

Abstract

התהליך של בידוד תאי T מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי (PBMCs) כדי להקים תרביות ex vivo הוא חיוני למחקר, בדיקות קליניות וטיפולים מבוססי תאים. במחקר זה מוצג פרוטוקול פשוט וחדשני לבידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מ-PBMCs ex vivo. מחקר זה משתמש בטכנולוגיית מיון תאים המופעלת על ידי ציפה פונקציונלית (BACS) כדי לבודד ולהפעיל תאי T. בקצרה, הפרוטוקול כולל בחירה חיובית של תאי CD3+ מ-PBMCs שמקורם בלוקופאק, ולאחר מכן גירוי משותף של 48 שעות עם מיקרו-שבבים של סטרפטווידין (SAMBs) הקשורים מראש נגד CD28 לפני ההתמרה בלוחות של 24 בארות. מיקרו-שבבים פונקציונליים מציעים הזדמנות ייחודית להפעיל תאים באופן צף, מה שמוביל לפנוטיפים מתרבים המאפשרים התרחבות עם תשישות מינימלית. טכניקה זו מציעה תשישות מופחתת מכיוון שהמיקרו-בועות הממריצות נשארות צפות וחוזרות לחלק העליון של מדיום התרבית, ובכך מפחיתות את משך הזמן שהתאים המתרחבים נמצאים במגע עם גורמי הגירוי המשותף. התוצאות מצביעות על כך שתאי ה-T המבודדים והתרבית מקבלים מספיק גירוי כדי להפעיל ולהתרבות, אך לא במידה שמובילה להפעלת יתר, מה שמוביל לאחר מכן לתשישות, כפי שמודגם על ידי נוכחות של PD-1 מוגזם.

Introduction

יותר מ-500 ניסויים קליניים בקולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T נערכים כיום ברחבי העולם, וארבעה מוצרים לטיפול בתאי CAR-T זמינים בשוק1. עם זאת, עדיין קיימים צרכי מחקר וייצור רבים של תאי CAR-T שיש לטפל בהם כדי לשפר את היעילות, המדרגיות וההצלחה ארוכת הטווח של טיפולים אלהשעשויים לרפא 2,3,4,5. המחקר והייצור הקליניים המאמצים של תאי CAR-T מתחילים בבידוד תאי T מדגימת דם היקפית ובגירוי, התמרה והרחבה של התאים המבודדים לאחר מכן. פרמטרים כגון התאוששות תאי T, טוהר ואותות הפעלה/תשישות דורשים שיקול דעת זהיר בעת בחירת טכניקות הבידוד והגירוי של התאים למחקר וייצור תאי CAR-T 3,4,6. חשוב לציין כי יש צורך בשיפור ההתמדה הטיפולית של טיפולים בתאי CAR-T על ידי מזעור המכשולים הביולוגיים הנובעים מתהליכי הייצור הנוכחיים, כגון תשישות תאי T, כדי לשפר את היעילות הטיפולית 6,7.

כחלופה לשיטות בידוד תאים מסורתיות כגון מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) ומיון תאים המופעלים על ידי מגנט (MACS), כאן, מודגם מיון תאים המופעל על ידי ציפה (BACS) עם מיקרו-בועות לבידוד תאי T. הפרדת מיקרו-בועות משתמשת במיקרו-כדורים צפים וחלולים (microbubbles) כדי לקשור את המטרות ולהציף אותן אל פני השטח של דגימות נוזלים 8,9. על ידי תפקוד מיקרו-שבבים עם נוגדנים (כלומר, אנטי-CD3), ניתן לבחור באופן חיובי את אוכלוסיות תאי ה-T הרצויות מדגימות דם היקפיות. לאחר מכן, השימוש באוכלוסייה שונה של מיקרו-שבבים מתפקדי נוגדנים (כלומר, אנטי-CD28) כדי לעורר ולהפעיל תאי T שנבחרו באופן חיובי בהשעיה מודגם בעבודה זו. Microbubbles מציעים זרימת עבודה פשוטה וניתנת לכוונון של בידוד והפעלה שמייצרת תאי T מוכנים לתרבית תאים מושהית וליישומים במורד הזרם כגון שינוי גנטי והרחבה. באופן קריטי, הפעלת תאים צפים עם מיקרו-שבבים מקדמת גירוי תאים מאופק כדי למנוע תשישות מוגזמת של תאי T7.

עבור מחקר זה, ציטומטריה של זרימה הייתה הכלי העיקרי ששימש לניתוח הצלחת הבידוד, ההפעלה וההתמרה של המיקרו-בועות הפונקציונליות, כמו גם כדי לספק מידע מפורט על תת-האוכלוסיות הספציפיות הקיימות בשלבי הצמיחה וההתרחבות שלאחר הטרנסדוקציה. בנוסף לציטומטריה של זרימה, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של שדה בהיר ופלואורסצנטי כדי לאשר את בריאות התא, המורפולוגיה והצלחת ההתמרת. בהתבסס על תוצאות אלה, הטכנולוגיה והפרוטוקול של microbubble מספקים חלופה מתכווננת ועדינה יותר לשיטות הבידוד וההפעלה המסורתיות הנמצאות כיום בשימוש; בפרט, תאים המופעלים על-ידי מיקרו-בועות מראים ביטוי נמוך יותר באופן ניכר של סמני תשישות של תאי T בהשוואה לתאים הנצפים בדרך כלל בכלים ובערכות המקובלים בתעשייה.

Protocol

1. בידוד של תאי T עם microbubbles באמצעות בחירה חיובית הערה: פרוטוקול זה מפרט גישת בחירה חיובית של CD3+ בקנה מידה קטן באמצעות SAMBs. דגירה 3 x 108 PBMCs שהושגו באופן מסחרי ב-2.5 מ”ל של חיץ הפרדה עם נוגדן אנטי-CD3 (OKT3) שעבר ביוטינילציה בריכוז של 25 ננוגרם נוגדן למיליון תאים …

Representative Results

תאי T בודדו מ-PBMCs שנרכשו וצופו להפעלה כמתואר בפרוטוקול. דגימות הבקרה השליליות (PBMCs שנרכשו) לא הופעלו. דגימות בקרה אלה נכללו כדי להדגים את ההשפעה שהייתה לתהליך ההפעלה של microbubble על דגימות הניסוי בהשוואה לבקרות תאי T שלא נגעו בהן ולא עוררו, והבטיחו כי סמני ההפעלה שנצפו היו תוצאה של גורמי ההפעלה ה…

Discussion

הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד של תאי T מדגימות PBMC והפעלה של תאי T מרחפים במדיית תרבית עם מיקרו-בועות. שיטה זו מסתמכת על מיקרו-שבבים פונקציונליים שהציפה הטבועה בהם מציעה הזדמנות ייחודית להכניס אותות מגרים משותפים לתאים ולהפעיל אותם בזמן שהם תלויים בתווך תרבית, ובכך להפחית את החשיפה של התאים …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ללא.

Materials

2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023 CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates VWR  76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody Biolegend 302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody Biolegend 317320
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IL2  BioVision (vwr) 10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 Takara Bio 0038VCT
Leukopak BioIVT HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs BioIVT HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture VWR 97063-708 CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated Innovative Research ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES Gibco 72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) Akadeum 11110-000

References

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).

Play Video

Cite This Article
Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).

View Video