Summary

Изоляция, активация и расширение Т-клеток на основе флотации из образцов мононуклеарных клеток периферической крови человека с использованием микропузырьков

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

Целью данного исследования является демонстрация возможности разделения на основе флотации для выделения, активации и расширения первичных Т-клеток человека.

Abstract

Процесс выделения Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) для создания культур ex vivo имеет решающее значение для исследований, клинических испытаний и клеточной терапии. В этом исследовании представлен простой, новый протокол для изоляции, активации и расширения Т-клеток из PBMCs ex vivo . В этом исследовании используется функционализированная технология сортировки клеток с активацией плавучести (BACS) для выделения и активации Т-клеток. Вкратце, протокол включает в себя положительный отбор клеток CD3+ из ПБМК, полученных из лейкопака, с последующей 48-часовой стимуляцией с предварительно конъюгированными анти-CD28-связанными микропузырьками стрептавидина (SAMB) до трансдукции в 24-луночных пластинах. Функционализированные микропузырьки предлагают уникальную возможность плавучей активации клеток, что приводит к пролиферативным фенотипам, которые позволяют расширяться с минимальным истощением. Этот метод обеспечивает снижение истощения, поскольку костимулирующие микропузырьки остаются плавучими и возвращаются в верхнюю часть питательной среды, тем самым уменьшая количество времени, в течение которого расширяющиеся клетки находятся в контакте с костимулирующими факторами. Результаты показывают, что изолированные и культивируемые Т-клетки получают достаточную стимуляцию для активации и пролиферации, но не до такой степени, которая приводит к гиперактивации, что затем приводит к истощению, о чем свидетельствует наличие избыточного PD-1.

Introduction

В настоящее время во всем мире проводится более 500 клинических испытаний терапии рецепторами химерного антигена (CAR)-Т-клетками, и четыре продукта car-T-клеточной терапии доступны на рынке1. Тем не менее, многочисленные потребности в исследованиях и производстве CAR-T-клеток все еще существуют, которые необходимо решить для повышения эффективности, масштабируемости и долгосрочного успеха этих потенциально лечебных методовлечения 2,3,4,5. Прикладные клинические исследования и производство CAR-T-клеток начинаются с выделения Т-клеток из образца периферической крови и последующей стимуляции, трансдукции и расширения изолированных клеток. Такие параметры, как восстановление Т-клеток, чистота и сигналы активации/истощения, требуют тщательного рассмотрения при выборе методов изоляции и стимуляции клеток для исследования и производства CAR-T-клеток 3,4,6. Важно отметить, что улучшение терапевтической стойкости CAR-T-клеточной терапии путем минимизации биологических препятствий, возникающих в результате текущих производственных процессов, таких как истощение Т-клеток, необходимо для повышения терапевтической эффективности 6,7.

В качестве альтернативы традиционным методам изоляции клеток, таким как флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) и магнитно-активированная сортировка клеток (MACS), здесь демонстрируется сортировка клеток с активацией плавучести (BACS) с микропузырьками для изоляции Т-клеток. Разделение микропузырьков использует плавучие, полые микросферы (микропузырьки) для связывания мишеней и вывоза их на поверхность образцов жидкости 8,9. Функционализируя микропузырьки антителами (т.е. анти-CD3), желаемые популяции Т-клеток могут быть положительно отобраны из образцов периферической крови. Впоследствии в данной работе продемонстрировано использование другой популяции микропузырьков, функционализированных антителами (т.е. анти-CD28) для совместной стимуляции и активации положительно отобранных Т-клеток в суспензии. Микропузырьки предлагают простой и настраиваемый рабочий процесс изоляции и активации, который генерирует Т-клетки, готовые к взвешенной клеточной культуре и последующим приложениям, таким как генетическая модификация и расширение. Критически важно, что активация плавучих клеток микропузырьками способствует сдержанной стимуляции клеток для предотвращения чрезмерного истощения Т-клеток7.

Для этого исследования проточная цитометрия была основным инструментом, используемым для анализа успеха выделения, активации и трансдукции функционализированных микропузырьков, а также для предоставления подробной информации о конкретных субпопуляциях, присутствующих во время фаз роста и расширения после трансдукции. В дополнение к проточной цитометрии, для подтверждения здоровья клеток, морфологии и успеха трансдукции использовалась ярко-полевая и флуоресцентная микроскопия. Основываясь на этих результатах, технология и протокол microbubble обеспечивают более настраиваемую и более мягкую альтернативу традиционным методам изоляции и активации, используемым в настоящее время; в частности, клетки, активированные микропузырем, демонстрируют заметно более низкую экспрессию маркеров истощения Т-клеток, чем та, которая обычно наблюдается с помощью стандартных инструментов и наборов.

Protocol

1. Выделение Т-клеток с микропузырьками с помощью положительного отбора ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол детализирует мелкомасштабный подход к положительному выбору CD3+ с использованием SAMB. Инкубировать 3 х 108 коммерчески полученных ПБМК в 2,5 мл раздел?…

Representative Results

Т-клетки были выделены из купленных NBMC и покрыты для активации, как описано в протоколе. Отрицательные контрольные образцы (приобретенные МПК) не активировались. Эти контрольные образцы были включены, чтобы продемонстрировать эффект, который процесс активации микропузырька оказал на ?…

Discussion

Описанный протокол позволяет выделять Т-клетки из образцов PBMC и активировать взвешенные Т-клетки в культуральных средах с микропузырьками. Этот метод опирается на функционализированные микропузырьки, присущая им плавучесть, дает уникальную возможность вводить в клетки костимулирую?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Никакой.

Materials

2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023 CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates VWR  76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody Biolegend 302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody Biolegend 317320
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IL2  BioVision (vwr) 10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 Takara Bio 0038VCT
Leukopak BioIVT HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs BioIVT HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture VWR 97063-708 CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated Innovative Research ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES Gibco 72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) Akadeum 11110-000

References

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).

Play Video

Cite This Article
Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).

View Video