Summary

Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

Bu çalışmanın amacı, primer insan T hücrelerini izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için yüzdürme bazlı ayırmanın fizibilitesini göstermektir.

Abstract

T hücrelerini ex vivo kültürler oluşturmak için periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ler) izole etme süreci, araştırma, klinik testler ve hücre bazlı tedaviler için çok önemlidir. Bu çalışmada, PBMC’lerden T hücrelerini ex vivo olarak izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için basit, yeni bir protokol sunulmuştur. Bu çalışma, T hücrelerini izole etmek ve aktive etmek için işlevselleştirilmiş yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) teknolojisini kullanmaktadır. Kısaca, protokol, lökopak türevi PBMC’lerden CD3 + hücrelerinin pozitif seçimini içerir, ardından 24 delikli plakalarda transdüksiyondan önce önceden konjuge anti-CD28’e bağlı streptavidin mikrokabarcıkları (SAMB’ler) ile 48 saatlik bir birlikte stimülasyon yapılır. İşlevselleştirilmiş mikro kabarcıklar, hücreleri yüzdürücü bir şekilde aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunarak, minimum tükenme ile genişlemeye izin veren proliferatif fenotiplere yol açar. Bu teknik, yardımcı uyarıcı mikro kabarcıklar yüzer kalır ve kültür ortamının tepesine geri döner, böylece genişleyen hücrelerin birlikte uyarıcı faktörlerle temas halinde olduğu süreyi azaltır. Sonuçlar, izole edilmiş ve kültürlenmiş T hücrelerinin aktive etmek ve çoğalmak için yeterli stimülasyon aldığını, ancak aşırı PD-1’in varlığının gösterdiği gibi aşırı aktivasyona yol açacak ölçüde değil, daha sonra tükenmeye yol açtığını göstermektedir.

Introduction

Şu anda dünya çapında 500’den fazla kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre tedavisi klinik çalışması yürütülmektedir ve piyasada dört CAR-T hücre tedavisi ürünü bulunmaktadır1. Bununla birlikte, bu potansiyel olarak iyileştirici tedavilerin etkinliğini, ölçeklenebilirliğini ve uzun vadeli başarısını artırmak için ele alınması gereken çok sayıda CAR-T hücre araştırması ve üretim ihtiyacı hala mevcuttur 2,3,4,5. Evlat edinilmiş CAR-T hücresi klinik araştırması ve üretimi, periferik bir kan örneğinden T hücresi izolasyonu ve ardından izole hücrelerin uyarılması, transdüksiyonu ve genişlemesi ile başlar. T hücresi geri kazanımı, saflık ve aktivasyon / tükenme sinyalleri gibi parametreler, CAR-T hücre araştırması ve üretimi için hücre izolasyonu ve stimülasyon tekniklerini seçerken dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır 3,4,6. Önemli olarak, terapötik etkinliği arttırmak için T hücresi tükenmesi gibi mevcut üretim süreçlerinden kaynaklanan biyolojik engelleri en aza indirgeyerek CAR-T hücre tedavilerinin terapötik kalıcılığında iyileşme gereklidir 6,7.

Floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik aktive hücre sıralama (MACS) gibi geleneksel hücre izolasyon yöntemlerine alternatif olarak, burada, T hücresi izolasyonu için mikro kabarcıklarla yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) gösterilmektedir. Mikrokabarcık ayırma, hedefleri bağlamak ve bunları sıvı numunelerinin yüzeyine yüzdürmek için yüzdürücü, içi boş mikrosferler (mikro kabarcıklar) kullanır 8,9. Mikrokabarcıkları antikorlarla (yani anti-CD3) işlevselleştirerek, istenen T hücresi popülasyonları periferik kan örneklerinden pozitif olarak seçilebilir. Daha sonra, süspansiyonda pozitif seçilmiş T hücrelerini birlikte uyarmak ve aktive etmek için farklı bir antikor işlevselleştirilmiş mikrokabarcık popülasyonunun (yani, anti-CD28) kullanımı bu çalışmada gösterilmiştir. Mikrokabarcıklar, askıya alınmış hücre kültürü ve genetik modifikasyon ve genişleme gibi aşağı akış uygulamaları için hazır T hücreleri üreten basit ve oldukça ayarlanabilir bir izolasyon ve aktivasyon iş akışı sunar. Kritik olarak, mikro kabarcıklarla yüzdürücü hücre aktivasyonu, aşırı T hücresi tükenmesini önlemek için kısıtlanmış hücre stimülasyonunu teşvik eder7.

Bu çalışma için, akış sitometrisi, işlevselleştirilmiş mikrokabarcıkların izolasyon, aktivasyon ve transdüksiyon başarısını analiz etmek ve transdüksiyon sonrası büyüme ve genişleme aşamalarında mevcut olan spesifik alt popülasyonlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak için kullanılan birincil araçtır. Akım sitometrisine ek olarak, hücre sağlığını, morfolojisini ve transdüksiyon başarısını doğrulamak için parlak alan ve floresan mikroskobu kullanıldı. Bu sonuçlara dayanarak, mikrokabarcık teknolojisi ve protokolü, günümüzde kullanılmakta olan geleneksel izolasyon ve aktivasyon yöntemlerine daha ayarlanabilir ve daha yumuşak bir alternatif sunmaktadır; Özellikle, mikrokabarcıkla aktive olmuş hücreler, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunu, endüstri standardı aletler ve kitlerle tipik olarak gözlemlenenden önemli ölçüde daha düşük gösterir.

Protocol

1. Pozitif seleksiyon kullanılarak T hücrelerinin mikrokabarcıklarla izolasyonu NOT: Bu protokol, SAMB’leri kullanan küçük ölçekli CD3+ pozitif seçim yaklaşımını ayrıntılarıyla açıklar. Ticari olarak elde edilen 3 x 108 PBMC’leri, 1 milyon hücre (25 ng / M) başına 25 ng antikor konsantrasyonunda biyotinile anti-CD3 (OKT3) antikoru ile 2.5 mL ayırma tamponunda inkübe edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karış…

Representative Results

T hücreleri satın alınan PBMC’lerden izole edildi ve protokolde açıklandığı gibi aktivasyon için kaplandı. Negatif kontrol örnekleri (satın alınan PBMC’ler) etkinleştirilmedi. Bu kontrol örnekleri, mikrokabarcık aktivasyon sürecinin, el değmemiş ve uyarılmamış T hücresi kontrollerine kıyasla deneysel numuneler üzerindeki etkisini göstermek için dahil edildi ve gözlemlenen aktivasyon belirteçlerinin eklenen aktivasyon faktörlerinin sonucu olmasını ve T hücrelerinin kendilerine özgü olmam…

Discussion

Tanımlanan protokol, PBMC örneklerinden T hücrelerinin izolasyonuna ve mikrokabarcıklarla kültür ortamındaki askıya alınmış T hücrelerinin aktivasyonuna izin verir. Bu yöntem, doğal kaldırma kuvveti hücrelere eş-uyarıcı sinyaller vermek ve bir kültür ortamında askıya alınırken bunları aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunan işlevselleştirilmiş mikro kabarcıklara dayanır, böylece genişleyen hücrelerin uzun süreli stimülasyona maruz kalmasını azaltır; Bu tür aşırı uyarım, T h…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Hiç kimse.

Materials

2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023 CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates VWR  76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody Biolegend 302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody Biolegend 317320
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IL2  BioVision (vwr) 10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 Takara Bio 0038VCT
Leukopak BioIVT HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs BioIVT HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture VWR 97063-708 CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated Innovative Research ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES Gibco 72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) Akadeum 11110-000

References

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).

Play Video

Cite This Article
Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).

View Video