Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Das Aufkommen von Direktelektronendetektorenⁱⁿ den letzten zehn Jahren ^1,2,3 hat zu einem exponentiellen Anstieg der Anzahl hochauflösender Strukturen von Makromolekülen und makromolekularen Anordnungen geführt, die mit Einzelpartikel-Kryo-EM 4,5,6 gelöst wurden. Es wird erwartet, dass fast alle gereinigten makromolekularen Spezies für die Strukturbestimmung mittels Kryo-EM geeignet sind, mit Ausnahme der kleinsten Proteine mit einer Größe von ~10 kDa oder unter⁷. Die Menge an Ausgangsmaterial, die für die Gittervorbereitung und Strukturbestimmung benötigt wird, ist mindestens um eine Größenordnung geringer als bei anderen Strukturbestimmungstechniken wie Kernspinresonanzspektroskopie und Röntgenkristallographie ^4,5,6.

Eine grundsätzliche Herausforderung bei der Strukturbestimmung mittels Kryo-EM besteht jedoch in der geeigneten Gittervorbereitung für die Bildgebung. Eine umfangreiche Studie, in der verschiedene Proben unter Verwendung unterschiedlicher Vitrifikationsstrategien und -gitter ausgewertet wurden, deutete darauf hin, dass die meisten Ansätze zur Vitrifizierung von Proben auf Kryo-EM-Gittern zu einer bevorzugten Adhärenz von Makromolekülen an der Luft-Wasser-Grenzfläche führen⁸. Eine solche Adhärenz kann potenziell zu vier suboptimalen Ergebnissen führen: (1) Die makromolekulare Probe denaturiert vollständig, in diesem Fall ist keine erfolgreiche Datenerhebung und -verarbeitung möglich; (2) Die Probe denaturiert teilweise, in diesem Fall kann es möglich sein, strukturelle Einblicke aus Regionen des Makromoleküls zu erhalten, die nicht beschädigt sind. (3) Die Probe behält ihre native Struktur bei, aber in den Bildern wird nur ein Satz von Teilchenorientierungen relativ zur Richtung des Elektronenstrahls dargestellt. (4) Die Probe behält ihre native Struktur bei, und einige, aber nicht alle möglichen Partikelorientierungen relativ zur Richtung des Elektronenstrahls sind in den Bildern dargestellt. In den Fällen (3) und (4) hilft die geneigte Datenerfassung bei der Minimierung der Anisotropie der Richtungsauflösung, die sich auf die rekonstruierte Kryo-EM-Karte auswirkt, und bietet eine verallgemeinerbare Lösung für eine Vielzahl von Proben⁹. Technisch gesehen kann die Neigung auch im Fall (2) von Vorteil sein, da die Denaturierung vermutlich an der Luft-Wasser-Grenzfläche stattfindet und in ähnlicher Weise die Anzahl der in den Daten dargestellten unterschiedlichen Orientierungen begrenzt. Das Ausmaß der Orientierungsverzerrung im Datensatz kann möglicherweise durch das Experimentieren mit Lösungsadditiven verändert werden, aber ein Mangel an breiter Anwendbarkeit behindert diese Trial-and-Error-Ansätze. Das Kippen des Probentisches um einen einzigen optimierten Neigungswinkel reicht aus, um die Verteilung der Orientierungen durch Änderung der Geometrie des Abbildungsexperiments⁹ zu verbessern (Abbildung 1). Aufgrund der geometrischen Konfiguration der bevorzugt ausgerichteten Probe in Bezug auf den Elektronenstrahl erzeugt die Neigung des Gitters für jeden Cluster bevorzugter Orientierungen einen Kegel von Beleuchtungswinkeln in Bezug auf den Cluster-Schwerpunkt. Dadurch werden die Ansichten ausgeweitet und folglich die Fourier-Raumabtastung und die Isotropie der Richtungsauflösung verbessert.

In der Praxis gibt es einige Nachteile, wenn man die Bühne kippt. Durch das Kippen des Probentisches wird ein Fokusgradient über das Sichtfeld eingeführt, der sich auf die Genauigkeit der CTF-Schätzungen (Contrast Transfer Function) auswirken kann. Die geneigte Datenerfassung kann auch zu einer erhöhten strahlinduzierten Partikelbewegung führen, die durch erhöhte Aufladungseffekte bei der Abbildung geneigter Proben verursacht wird. Die Gitterneigung führt auch zu einer Zunahme der scheinbaren Eisdicke, was wiederum zu verrauschten Schliffbildern führt und letztendlich die Auflösung von Rekonstruktionen beeinflussen^kann 5,9,10. Es kann möglich sein, diese Probleme zu überwinden, indem fortgeschrittene computergestützte Datenverarbeitungsschemata angewendet werden, die in den Protokoll- und Diskussionsabschnitten kurz beschrieben werden. Schließlich kann das Kippen zu einer erhöhten Partikelüberlappung führen, was die nachfolgende Bildverarbeitungspipeline behindert. Obwohl dies bis zu einem gewissen Grad durch die Optimierung der Partikelkonzentration im Netz gemildert werden kann, ist dies dennoch ein wichtiger Aspekt. Hier wird ein einfach zu implementierendes Protokoll für die geneigte Datenerfassung mit der Leginon Software Suite (einer automatisierten Bilderfassungssoftware) beschrieben, das frei zugänglich und mit einer breiten Palette von Mikroskopen^{kompatibel ist 11,12,13,14}. Die Methode erfordert mindestens Version 3.0 oder höher, wobei die Version 3.3 ab Version 3.3 dedizierte Verbesserungen enthält, um eine geneigte Datenerfassung zu ermöglichen. Für dieses Protokoll ist keine zusätzliche Software oder Ausrüstung erforderlich. Ausführliche Anweisungen zur Recheninfrastruktur und zu Installationsanleitungen finden Sie an anderer Stelle¹⁵.