Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

De komst van directe elektronendetectoren in het afgelopen decennium ^1,2,3 heeft geleid tot een exponentiële toename van het aantal hoge-resolutiestructuren van macromoleculen en macromoleculaire assemblages opgelost met behulp van cryo-EM ^4,5,6 met één deeltje. Bijna alle gezuiverde macromoleculaire soorten zijn naar verwachting vatbaar voor structuurbepaling met behulp van cryo-EM, behalve de kleinste eiwitten ~ 10 kDa in grootte of lager dan⁷. De hoeveelheid uitgangsmateriaal die nodig is voor rastervoorbereiding en structuurbepaling is ten minste een orde van grootte kleiner dan andere structuurbepalingstechnieken, zoals kernspinresonantiespectroscopie en röntgenkristallografie ^4,5,6.

Een belangrijke uitdaging voor structuurbepaling door cryo-EM is echter een geschikte rastervoorbereiding voor beeldvorming. Een uitgebreide studie die diverse monsters evalueerde met behulp van verschillende vitrificatiestrategieën en -roosters suggereerde dat de meeste benaderingen voor het verglazen van monsters op cryo-EM-roosters leiden tot preferentiële hechting van macromoleculen aan de lucht-waterinterface⁸. Een dergelijke hechting kan mogelijk vier suboptimale uitkomsten veroorzaken: (1) het macromoleculaire monster denatureert volledig, in welk geval geen succesvolle gegevensverzameling en -verwerking mogelijk is; (2) het monster denatureert gedeeltelijk, in welk geval het mogelijk kan zijn om structurele inzichten te verkrijgen uit gebieden van het macromolecuul die niet zijn beschadigd; (3) het monster behoudt de oorspronkelijke structuur, maar slechts één reeks deeltjesoriëntaties ten opzichte van de richting van de elektronenbundel wordt in de afbeeldingen weergegeven; (4) Het monster behoudt de oorspronkelijke structuur en sommige, maar niet alle mogelijke deeltjesoriëntaties ten opzichte van de richting van de elektronenbundel worden weergegeven in de afbeeldingen. Voor gevallen (3) en (4) zal gekantelde gegevensverzameling helpen bij het minimaliseren van directionele resolutie-anisotropie die de gereconstrueerde cryo-EM-kaart beïnvloedt en biedt een generaliseerbare oplossing voor een breed scala aan monsters⁹. Technisch gezien kan kantelen ook het geval (2) ten goede komen, omdat de denaturatie vermoedelijk plaatsvindt op het lucht-water-grensvlak en op dezelfde manier het aantal verschillende oriëntaties beperkt dat in de gegevens wordt weergegeven. De mate van oriëntatiebias in de dataset kan mogelijk worden gewijzigd door te experimenteren met oplossingsadditieven, maar een gebrek aan brede toepasbaarheid belemmert deze trial-and-error-benaderingen. Het kantelen van de monstertrap onder een enkele geoptimaliseerde kantelhoek is voldoende om de verdeling van oriëntaties te verbeteren door de geometrie van het beeldvormingsexperiment⁹ te wijzigen (figuur 1). Vanwege de geometrische configuratie van het bij voorkeur georiënteerde monster ten opzichte van de elektronenbundel, genereert het kantelen van het raster voor elk cluster van voorkeursoriëntaties een kegel van verlichtingshoeken ten opzichte van het clustercentroïde. Dit spreidt de weergaven dus en verbetert bijgevolg fourierruimtebemonstering en de isotropie van directionele resolutie.

Er kleven in de praktijk wel wat nadelen aan het kantelen van het podium. Het kantelen van de monsterfase introduceert een focusverloop over het gezichtsveld, wat van invloed kan zijn op de nauwkeurigheid van CTF-schattingen (Contrast Transfer Function). Gekantelde gegevensverzameling kan ook leiden tot een verhoogde door de bundel geïnduceerde deeltjesbeweging veroorzaakt door verhoogde ladingseffecten bij het in beeld brengen van gekantelde monsters. Rasterkanteling leidt ook tot een toename van de schijnbare ijsdikte, wat op zijn beurt leidt tot luidruchtigere micrografieën en uiteindelijk de resolutie van reconstructies kan beïnvloeden ^5,9,10. Het is mogelijk om deze problemen op te lossen door geavanceerde computationele gegevensverwerkingsschema’s toe te passen die kort worden beschreven in de protocol- en discussiesecties. Ten slotte kan kantelen leiden tot een grotere overlapping van deeltjes, waardoor de daaropvolgende beeldverwerkingspijplijn wordt belemmerd. Hoewel dit tot op zekere hoogte kan worden verzacht door de deeltjesconcentratie op het net te optimaliseren, is het toch een belangrijke overweging. Hier wordt een eenvoudig te implementeren protocol beschreven voor gekantelde gegevensverzameling met behulp van de Leginon-softwaresuite (een geautomatiseerde beeldacquisitiesoftware), beschikbaar open access en compatibel met een breed scala aan microscopen^11,12,13,14. De methode vereist ten minste versie 3.0 of hoger, met versies 3.3 en hoger die speciale verbeteringen bevatten om gekantelde gegevensverzameling mogelijk te maken. Voor dit protocol is geen extra software of apparatuur nodig. Uitgebreide instructies over computationele infrastructuur en installatiehandleidingen zijn elders te vinden¹⁵.