Mycobacterium tuberculosis Ekstracellulær vesikkelberikelse gjennom størrelsesekskluderingskromatografi

Frigjøring av ekstracellulære vesikkel (EV) av patogener kan være nøkkelen til å låse opp ny teknologi for å kontrollere smittsomme sykdommer¹. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) er et patogen av høy konsekvens, infiserer omtrent en tredjedel av verdens befolkning og krever livet til millioner av mennesker hvert år². EV-produksjon av Mtb er godt dokumentert, men likevel unnvikende i biogenesen og varierte roller (dvs. immunostimulerende, immunosuppressiv, jern og næringsoppkjøp) av disse EV-ene i forbindelse med infeksjon ^3,4,5. Forsøk på å forstå sammensetningen av Mtb EV avslørte 50-150 nm lipidmembranlukkede kuler avledet fra plasmamembranen som inneholder lipider og proteiner av immunologisk betydning ^3,6. Undersøkelse av rollen til MTB EV i bakteriell fysiologi har avslørt betydningen av bakteriell EV-modulering som svar på miljøstress for overlevelse⁵. Host-patogen interaksjonsstudier har vært mer kompliserte å tolke, men bevis indikerer at Mtb EV kan påvirke immunresponsen til verten og potensielt kan tjene som en effektiv vaksinasjonskomponent ^3,4,7.

De fleste studier av MTB-elbiler så langt har basert seg på tetthetsgradient ultrasentrifugering for vesikkelberikelse⁸. Dette har vært effektivt for småskala studier; Denne teknikken har imidlertid flere tekniske og logistiske utfordringer. Alternative arbeidsflyter par multistep sentrifugering, for fjerning av hele celler og store rusk, med en siste ultracentrifugation trinn til pellet EV. Denne metoden kan variere i effektivitet, og resulterer ofte i lavt utbytte og korensing av løselige ikke-vesikkelassosierte biomolekyler samtidig som den påvirker vesikkelategritet⁹. I tillegg er denne prosessen tidkrevende, manuelt intensiv og svært begrenset i gjennomstrømning på grunn av utstyrsbegrensninger.

Denne protokollen beskriver en alternativ teknikk til tetthetsgradient ultrasentrifugering: størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Denne metoden har blitt demonstrert for miljømykobakterier, og i det nåværende arbeidet har den blitt ekstrapolert til Mtb¹⁰. En kommersielt tilgjengelig kolonne- og automatisk fraksjonssamler kan forbedre konsistensen i vesisk forberedelse og redusere behovet for spesifikt, dyrt utstyr. Det er også mulig å fullføre denne protokollen på en brøkdel av tiden sammenlignet med tetthetsgradient ultracentrifugation, noe som øker gjennomstrømningen. Denne teknikken er mindre teknisk utfordrende, noe som gjør det lettere å mestre, og kan øke inter / intra-laboratoriet reproduserbarhet. Endelig har SEC høy separasjonseffektivitet og er mild, og bevarer vesiklernes integritet.

Colorado State University Institutional Biosafety Committee godkjente denne studien (19-046B). Dyrking av Mycobacterium tuberculosis og høsting av ev-rike kultursupernatanter ble utført av opplært personell i et høyoppsamlingslaboratorium. Materialene ble flyttet ut av høyoppsamlingsområdet etter at en gyldig inaktiveringsmetode ble utført, bekreftet og godkjent av institusjonelle biosikkerhetspolitikker. Selv om det ikke er mulig å replikere protokollen, hvis validert inaktivering eller steril filtreringsmetode ikke er mulig, må følgende prosedyrer utføres i et laboratorium med høy inneslutning.

1. Tilberedning av rå Mtb EV konsentrat

MERK: For detaljerte prosedyrer for dyrking av Mtb og fremstilling av kulturfiltratprotein (CFP), se Referanser^11,12. Det anbefales at bakteriekulturmedier er fri for veksttilskudd med EV-holdige eller proteinholdige komponenter, som Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC), og vaskemidler som Tween. Det anbefales også at bakteriekulturens kvalitet og høstet CFP screenes for å sikre begrenset celledød og lysis^13,14.

1. Forbered et 100 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) sentrifugalfilter (se materialtabell) ved å legge til full volumkapasitet av fosfatbufret saltvann (1x PBS). Sentrifuge i 5 min ved 2 800 x g ved 4 °C.
   MERK: Hvis du bruker et filter uten dødstoppvolum, må det utvises forsiktighet for å sikre at prøvevolumet ikke reduseres under filternivået, noe som resulterer i fullstendig filtertørking under sentrifugering.
2. Kast gjennomstrømningen og eventuell gjenværende PBS før prøvekammeret fylles med Mtb CFP til maksimal kapasitet. Sentrifuge ved 2 800 x g ved 4 °C til volumet er redusert til minimumsvolumet til ultrafiltreringsenheten. Gjenta etter behov, og legg til mer CFP til enheten til hele prøven er redusert tilstrekkelig.
   MERK: Behold en del av 100 kDa gjennomstrømningsmaterialet (100F) for nedstrømskvalifisering hvis ønskelig. Oppbevares ved 4 °C.
3. Tilsett 1x PBS til filterenheten som inneholder konsentratet, opp til den totale enhetskapasiteten. Reduser volumet som beskrevet i 1.2. Gjenta dette trinnet fem ganger for å sikre fullstendig vask og bufferbytte.
4. Gjenopprett 100 kDa konsentrert CFP-retentat (100R) i henhold til spesifikasjonene for ultrafiltreringsenheten (se materialtabell). Når 100R er gjenopprettet, vask filteret med et minimalt volum på 1x PBS minst tre ganger, og basseng vasken med 100R for å maksimere utvinningen.
5. Kvantifiser 100R-materialet med en bicinchoninisk analyse (BCA) i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). For å utføre analysen, bruk flere fortynninger av prøvene 1: 2, 1: 5 og 1: 10 i PBS. Test prøven i tre eksemplarer.
   MERK: Behold en del av 100R-materialet for nedstrømskvalifisering hvis ønskelig. Oppbevares ved 4 °C.

2. Størrelsesekskluderingskromatografi for anrikning av Mtb EV fra CFP

MERK: Følgende prosedyre er spesifikk for bruk av 3 mg 100R Mtb CFP med SEC-kolonne og automatisk brøksamler (AFC, se Materialtabell). Den kan tilpasses for andre startkonsentrasjoner og kolonnetyper ved å følge produsentens spesifikasjoner. I tillegg anbefales brukerne å lese og forstå brukerhåndboken for automatisk brøksamler.

1. La SEC-kolonnen balansere til romtemperatur.
2. Slå på AFC ved hjelp av strømbryteren på baksiden av tårnenheten, og juster om nødvendig innstillingene for lastcellen ved å trykke på SETUP på berøringsskjermen på hovedmenyen. Lastcellen må bare kalibreres ved første gangs bruk, etter hver programvareoppdatering, og hvis det oppdages inkonsekvens i brøkinnsamlingsvolumer.
3. Juster karusellen fra OPPSETT-skjermen ved å velge KARUSELL > KALIBRER. Sett karusellen med de 13 små hullene vendt opp i AFC-tårnet, og juster karusellen slik at væskedysen er rett over spyleposisjonen ved å trykke på - og/eller + knappene.
4. Fjern capsene fra den likevektede SEC-kolonnen. Skyv SEC-kolonnen inn i riktig kolonnefeste og installer den forsiktig på AFC-tårnet. Forsikre deg om at RFID -taggen (radiofrekvensidentifikasjon) på kolonnen vender mot AFC, og kontroller at forbindelsen mellom kolonnen og ventilen er sikker. Plasser avfallsrøret i en oppsamlingsbeholder.
5. Fra skjermbildet OPPSETT velger du Samlingsplan og setter antallet til 13 og størrelsen til 0,5 ml ved å trykke på - og/eller + knappene. La "Buffervolum" -innstillingen være standard på 2,7 ml, og lukk deretter vinduet "Samlingsplan" ved å trykke på X.
6. Velg START SAMLING fra startskjermen og bekreft samlingsparametrene ved å velge JA. Last 13 merket 1,7 ml mikrosentrifugerrør med lokkene åpne og pekende mot karusellsenteret.
7. Gå videre til AFC ved å velge OK, monter deretter kolonnereservoaret og gå videre igjen ved å trykke på OK. Velg alternativet for å spyle kolonnen ved å trykke JA, og legg til ett kolonnevolum på 0,2 μm filtrert PBS for å fjerne eventuell lagringsbuffer. Når spylingen er fullført, avanser AFC ved å trykke på OK.
8. Plasser karuselldekselet over AFC og trykk på OK. Forbered ett kolonnevolum på 0,2 μm filtrert PBS. Bruk en pipette for å fjerne overflødig buffer fra kolonnen.
9. Ta med 3 mg 100R prøve som kvantifisert i trinn 1,5 til 500 μL med 1x PBS. Legg til prøven på 3 mg øverst i kolonnen. Advance AFC og la prøven til å kjøre inn i frit. Når prøven har kommet helt inn i kolonnen, legger du til PBS utarbeidet i trinn 2.6 i reservoaret.
10. Overvåk kjøringen av AFC mens den samler først tomrommet og deretter de angitte brøkene. Etter at løpet er fullført og karusellen går tilbake til avfallsposisjon, fjern dekselet og fjern brøkdelrørene fra karusellen. Oppbevar brøkene ved 4 °C før kvantifisering (trinn 3) og kvalifisering (trinn 4).
11. Hvis kolonnen skal brukes på nytt, velger du alternativet for å rense kolonnen ved å trykke JA. Ellers trykker du på NO. Følg instruksjonene på AFC.
    MERK: Når kolonnen er vasket og lagringsbufferen har gått gjennom, kan den fjernes, kappes og lagres ved 4 °C.

3. Kvantifisering av MTB-elbilene

1. Mål proteinkonsentrasjonen for hver fraksjon ved hjelp av BCA og mikro BCA¹².
   1. For 0,5 ml fraksjoner samlet fra 3 mg 100R Mtb CFP, bruk mikro BCA med en 1:3 fortynning for fraksjoner nummerert 1-7 av hver prøve i tre eksemplarer.
   2. For 0,5 ml fraksjonert 5-13, bruk BCA uten fortynning for hver prøve i tre eksemplarer.
      MERK: Overlapping av analysene for brøk 5-7 vil bidra til å sikre at alle brøker har en lesbar utgang.
2. Kvantifiser partikkelkonsentrasjonen for hver fraksjon ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA).
   1. Fortynn prøvene i 1 ml 1x PBS ved å bruke følgende foreslåtte startforhold; for fraksjoner 1-3, bruk 1:100, og bruk deretter en 1:10 fortynning for de resterende fraksjonene.
   2. Vortex de fortynnede løsningene og trekk deretter prøven inn i en 1 ml engangssprøyte. Sett sprøyten i en automatisk sprøytepumpe hvis tilgjengelig.
   3. Sett sprøytepumpen på 30 μL/min og bruk innstillingene for videoopptak med en skjermforsterkning på 10–12 og et kameranivå på 10–12. Juster fokus for hvert eksempel.
   4. Samle minst tre videoer på 30 s hver ved hjelp av en konstant flyt.
   5. Utfør analysen med programvaredeteksjonsterskelen satt til fem.
      MERK: Det er kanskje ikke mulig å skaffe NTA-data for de nyeste brøkene (>7) uten å ofre betydelig prøvevolum.

4. Kvalifisering av MTB EV

1. Visualiser den generelle proteinprofilen til hver fraksjon ved hjelp av en sølvfarget proteingel.
   MERK: Detaljerte prosedyrer for SDS-PAGE og sølvflekk finnes i Referanse¹⁵.
   1. Tilsett SDS-prøvebuffer til 10 μL av hver fraksjon og 5 μg CFP, 100R og 100F. Kok i 5 min ved 100 °C, og last deretter på en 4%-12% Bis-Tris Gel med en molekylvektstige for polyakrylamidgelelektroforese (SIDE) (se Materialtabell).
   2. Kjør gelen med 1x 2-[N-morpholino]etansulfonsyre (MES) løpebuffer (se materialtabell) og en 200 V strøm i 35 minutter.
   3. Fjern gelen fra kassetten og fortsett med sølvfarging¹⁵.
2. Evaluer tilstedeværelsen eller fraværet av EV-markører i hver brøkdel av Western blot.
   MERK: Detaljerte prosedyrer for Western blotting finnes i Referanse¹⁵.
   1. Kjør en SDS-PAGE gel som beskrevet i trinn 4.1.1-4.1.2.
   2. Fjern gelen fra kassetten og overfør de oppløste proteinene til en nitrocellulosemembran på 0,2 μm (se materialtabellen) ved å påføre en 50 V strøm i minst 1 time.
   3. Utfør Western blot-analyse for å evaluere proteiner av interesse. Primære antistoffer mot LpqH, lipoarabinomannan (LAM) og GroES (se materialtabell) anbefales.
   4. Bassengfraksjoner basert på tilstedeværelse eller fravær av markører etter behov for nedstrømsapplikasjonen.
3. Bekreft tilstedeværelsen av intakte vesikler ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM).
   1. Fest 15 μL av vesikkelprøven ved å tilsette 15 μL 4% EM-paraformaldehyd og lagre ved 4 ° C over natten.
   2. Forbered et 200 mesh formvar-karbonbelagt kobber TEM-rutenett ved å rengjøre overflaten og lage et hydrofilt substrat.
      MERK: Plasmarengjøring med 95% argon, 5% oksygen og 30% plasmakraft i 1 min anbefales.
   3. Slipp 10 μL av den faste prøven på rutenettet og la prøven feste seg i 10 minutter, og fjern deretter overflødig væske med filterpapir.
   4. Flyt rutenettet på en dråpe ultrarent vann i 30 s, og fjern deretter overflødig væske.
   5. Flyt rutenettet på en d% EM-klasse uranylacetatdråpe i 2 minutter, og fjern deretter overflødig væske.
   6. La gitteret lufttørke helt.
   7. Bilde med TEM (se Materialtabell) på 100 kV eller lignende.
      MERK: Andre EV-kvantifiserings- og karakteriseringsmetoder bør brukes basert på nedstrømsapplikasjoner. Minimal informasjon for studier av ekstracellulære vesikler¹⁸ bør konsulteres for retningslinjer for å sikre strenghet og reproduserbarhet av alle EV-studier.

Kulturfiltratprotein (CFP) fra Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ble konsentrert, kvantifisert, og deretter ble 3 mg materiale påført en størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) kolonne. Protein- og partikkelkonsentrasjonene ble oppregnet av henholdsvis BCA og NTA. Forventede områder for protein- og partikkelutvinning pluss de nøyaktige verdiene oppnådd for disse resultatene er rapportert i tabell 1. Verdier som er mye høyere enn disse områdene, kan indikere kontaminering eller problemer med kolonneintegritet. Verdier som er betydelig lavere peker på problemer i ultrafiltreringstrinnene, og derfor må gjennomstrømningen sammenlignes med start-CFP og 100R for å avgjøre om en vellykket konsentrasjon oppstod. En uspesifikk protein sølvflekk viser at senere fraksjoner inneholder mer protein og ligner 100R-materialet (figur 1).

Western blots av fraksjonene viser at lipoarabinomannan (LAM) er tilstede over fraksjonene, med senere fraksjoner som viser lavere intensitetsbånd (figur 2A, supplerende figur 1). 19 kDa lipoprotein LpqH, kjent for å være til stede i Mtb EV ^3,19, er beriket i de tidligste fraksjonene fra SEC (figur 2B, supplerende figur 1). 10 kDa chaperoninproteinet GroES er fraværende i de tidligste fraksjonene fra SEC (figur 2C, supplerende figur 1); Dette funnet stemmer overens med tidligere publiserte studier angående GroES som forurensning under Mtb EV-anrikning¹² og fungerer som en negativ kontroll for Mtb EV-tilstedeværelse. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bekrefter tilstedeværelsen av lukkede, membranbundne vesikler (figur 3A). En sammenligning av MTB-elbiler atskilt med tetthetsgradient ultrafiltrering og denne SEC-metoden er rapportert i tabell 2. SEC gir høyere protein- og partikkelgjenvinning for tre tekniske replikasjoner fra samme CFP. Disse resultatene har vært konsistente på tvers av flere grupper av CFP (data ikke vist). Begge metodene resulterer i lukkede, membranbundne vesikler i forventet størrelsesområde, som vist ved TEM (figur 3) og NTA (figur 4).

Til sammen demonstrerer disse dataene berikelse av MTB-elbiler i de tidlige SEC-fraksjonene. De høyeste NTA-verdiene forekommer i fraksjonene 1-3, og proteininnholdet øker etter hvert som fraksjonstallet stiger, noe som indikerer separasjonen av oppløselige proteiner fra EV-ene (tabell 1). Fordi fraksjon 4 inneholder holdepunkter for GroES (figur 2C, supplerende figur 1), ble ikke denne fraksjonen inkludert i det samlede materialet for TEM. Avhengig av nedstrømsapplikasjonen må inkludering eller utelukkelse av spesifikke brøker for sammenslåingsstrategien vurderes.

Figur 1: Sølvflekk etter brøk. En SDS-PAGE gel farget med sølv demonstrerer den totale proteinprofilen for hver fraksjon. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC fraksjoner 1-11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Western blots etter brøk. Western blots oppdager (A) LAM, (B) LpqH og (C) GroES, og demonstrerer proteinmarkørendringer på tvers av fraksjonene. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC fraksjoner 1-11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilder. (A) SEC fraksjoner 1-3 samlet før fiksering. (B) Tetthetsgradientens ultrasentrifugering av Mtb EV-er ble negativt farget for TEM-avbildning. Skala barer = 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) distribusjon. (A) SEC fraksjoner 1-3. (B) Tetthetsgradienten ultracentrifugation Mtb EV ble analysert med nanopartikkelsporingsanalyse. Størrelsesfordelingen vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Protein- og partikkelgjenvinning etter fraksjon. Forventet protein- og partikkelgjenvinningsområde per fraksjon basert på 3 mg utgangsmateriale. De nøyaktige verdiene for å skaffe materialet som ble brukt i denne studien, er inkludert i de to kolonnene lengst til høyre.

Tabell 2: Metodesammenligning av protein- og partikkelutvinning. Proteinutbytte målt med BCA og totalt partikkelantall målt ved NTA for Mtb-elbiler som stammer fra 3 mg av samme 100R utgangsmateriale, beriket ved hjelp av den refererte tetthetsgradienten ultrasentrifugeringsmetode⁸ eller denne SEC-metoden (triplikat).

Supplerende figur 1: Originale Western blots (uncropped) fra figur 2. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler er svært antigene reservoarer, som presenterer dem som en attraktiv vei for å utvikle diagnostiske verktøy og fremtidige vaksiner ^4,19,20. Historisk sett har tetthetsgradient ultrasentrifugering blitt brukt til å skille Mtb-elbiler fra andre løselige, utskilte materialer⁸. Selv om denne prosessen er effektiv, er den også tidkrevende, teknisk utfordrende og kan påvirke integriteten til de resulterende EV-preparatene ^9,10. Den presenterte protokollen tilbyr en alternativ metode for Mtb EV-preparater gjennom størrelseseksklusjonskromatografi (SEC).

Det er flere kritiske punkter for å lykkes i denne metoden. Det første Mtb CFP-preparatet vil påvirke kvaliteten og utbyttet av vesikler etter SEC. Det anbefales at CFP høstes på eller før vekstfasen for å begrense nivået av cellulær lysis på høstingstidspunktet. Sen-log og stasjonære vekstfasekulturer kan inneholde høyere nivåer av cellelyse og kan resultere i identifisering av intracellulære proteiner og artefaktuelle EV-lignende strukturer, spontant generert fra membranfragmentene til de lysede cellene, som en betydelig bidragsyter til den innsamlede CFP 12,13,14 . Dette bør evalueres før denne protokollen påbegynnes, da membranvesikler fra lysede celler vil renses sammen med utskilte Mtb-elbiler og potensielle skjevheter nedstrømsanalyser. Det må utvises forsiktighet under ultrafiltrering for å sikre at filtermembranen forblir intakt og våt. Skader på filteret kan føre til at ønsket materiale strømmer gjennom. Inkludert den opprinnelige CFP, 100R og 100F på nedstrøms kvalitetsevalueringer vil bistå i evalueringen av ultrafiltreringsintegritet.

Riktig oppsett og vask av SEC-kolonnen er nødvendig for EV-forberedelse av høyeste kvalitet. Følg alltid brukerhåndbøkene for oppsett og fjerning. Mens fraksjoner samles inn, må du sørge for at AFC ikke støtes eller flyttes, da dette kan avbryte prosessen og føre til hoppede eller inkonsekvente brøker. Antistoffene som brukes til kvalifisering vil avhenge av nedstrøms bruk av de berikede vesiklene, og bør inkludere en markør som forventes å være i Mtb EV (LpqH) og en markør som finnes i CFP, men ikke beriket i Mtb EV (GroES). En begrensning i metodene som presenteres her er potensiell variasjon i passende proteinkontroller. Denne protokollen er utviklet ved hjelp av standard dyrkingsmetoder. Arbeid utført med Mycobacterium avium antydet at nivåer av chaperoniner som GroES endres i CFP og EV basert på mediet som brukes til vekst²¹. Etter hvert som det kommer mer informasjon om mykobakteriell EV-sammensetning, kan det være nødvendig å justere den spesifikke negative kontrollmarkøren.

Til slutt bør alle kvantifiserings- og kvalifiseringsprosedyrer og nedstrømsapplikasjoner utføres raskt. Hvis materiallagring er nødvendig, anbefales 4 °C fremfor frysing for å forhindre forstyrrelse av vesikkelens integritet under fryse-tineprosessen. Hvis frysing utføres, aliquot materialet for å unngå gjentatte fryse-tine sykluser. Berikede elbiler bør revurderes både kvantitativt og kvalitativt hvis det går betydelig tid mellom den første evalueringen og bruken.

Denne metoden beriker effektivt MTB-elbiler, og det er fleksibilitet for tilpasning til andre mykobakterier. Når du tilpasser denne prosedyren for andre organismer, må du sørge for at startkulturen har begrenset cellulær lysis. Mengden materiale som er lastet på kolonnen, bør justeres, da kinetikken til EV-frigjøringen vil variere. Ikke overskrid en maksimal proteinkonsentrasjon på 7 g per 100 ml basert på produsentens spesifikasjoner. Det er også nødvendig å evaluere hver fraksjon individuelt for tilstedeværelse av EV-assosierte markører og forurensninger. Proteinkonsentrasjon og NTA-data kan være misvisende i metodeoptimalisering: svært lav proteinkonsentrasjon betyr ikke fravær av vesikler i disse fraksjonene. Hvis du endrer SEC-kolonner og brøkinnsamlingsparametere, kan brukeren i tillegg skalere protokollen basert på inndata- og nedstrømsprogrammer. Begrensninger av denne metoden inkluderer kostnaden for AFC og forbruksvarer, fortynnet utgang, og, som nevnt tidligere, utvikling og optimalisering av fraksjonssammenslåingsordningen. Mens tetthetsgradient ultracentrifugation har sine fordeler og kanskje mer anvendelig for visse eksperimenter, er berikelse av MTB EV av SEC sammenlignbar i kvalitet og overlegen i tilgang og brukervennlighet, som presentert her.