Mycobacterium tuberculosis Enrichissement extracellulaire des vésicules par chromatographie d’exclusion de taille

La libération de vésicules extracellulaires (VE) par des agents pathogènes peut être la clé pour déverrouiller de nouvelles technologies pour contrôler les maladies infectieuses¹. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un agent pathogène de grande importance, infectant environ un tiers de la population mondiale et coûtant la vie à des millions de personnes chaque année². La production de VE par Mtb est bien documentée mais insaisissable dans la biogenèse et les rôles variés (c.-à-d. immunostimulant, immunosuppresseur, acquisition de fer et de nutriments) de ces VE dans le contexte de l’infection ^3,4,5. Les efforts pour comprendre la composition des VE Mtb ont révélé des sphères enveloppées de membrane lipidique de 50 à 150 nm dérivées de la membrane plasmique contenant des lipides et des protéines d’importance immunologique ^3,6. L’étude du rôle des VE VTT dans la physiologie bactérienne a révélé l’importance de la modulation bactérienne ev en réponse au stress environnemental pour la survie⁵. Les études d’interaction hôte-pathogène ont été plus compliquées à interpréter, mais les preuves indiquent que les VE MTB peuvent influencer la réponse immunitaire de l’hôte et peuvent potentiellement servir de composante vaccinale efficace ^3,4,7.

Jusqu’à présent, la plupart des études sur les véhicules électriques VTT se sont appuyées sur l’ultracentrifugation par gradient de densité pour l’enrichissement des vésicules⁸. Cela a été efficace pour les études à petite échelle; cependant, cette technique présente plusieurs défis techniques et logistiques. Des flux de travail alternatifs associent la centrifugation en plusieurs étapes, pour l’élimination des cellules entières et des gros débris, à une étape finale d’ultracentrifugation pour pelleter les véhicules électriques. Cette méthodologie peut varier en efficacité et entraîne souvent un faible rendement et une co-purification des biomolécules solubles non associées aux vésicules tout en ayant un impact sur l’intégrité des vésicules⁹. De plus, ce processus prend beaucoup de temps, est manuel et son débit est très limité en raison des contraintes de l’équipement.

Le présent protocole décrit une technique alternative à l’ultracentrifugation par gradient de densité : la chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Cette méthode a été démontrée pour les mycobactéries environnementales, et dans les travaux actuels, elle a été extrapolée à Mtb¹⁰. Une colonne disponible dans le commerce et un collecteur de fraction automatique peuvent améliorer la cohérence de la préparation vésicale et réduire la nécessité d’un équipement spécifique et coûteux. Il est également possible de compléter ce protocole en une fraction du temps par rapport à l’ultracentrifugation à gradient de densité, ce qui augmente le débit. Cette technique est moins difficile techniquement, ce qui la rend plus facile à maîtriser, et peut augmenter la reproductibilité inter/intra-laboratoire. Enfin, le SEC a une efficacité de séparation élevée et est doux, préservant l’intégrité des vésicules.

Le Comité institutionnel de biosécurité de l’Université d’État du Colorado a approuvé la présente étude (19-046B). La culture de Mycobacterium tuberculosis et la récolte de surnageants de culture riches en EV ont été effectuées par du personnel qualifié dans un laboratoire à haut confinement. Les matériaux ont été déplacés hors de la zone de confinement élevé après qu’une méthode d’inactivation valide a été effectuée, confirmée et approuvée par les politiques de biosécurité de l’établissement. Lors de la réplication du protocole, si une méthode d’inactivation ou de filtration stérile validée n’est pas réalisable, les procédures suivantes doivent être effectuées dans un laboratoire à haut confinement.

1. Préparation du concentré brut Mtb EV

NOTE: Pour les procédures détaillées relatives à la culture du Mtb et à la préparation de la protéine de filtrat de culture (CFP), voir les références^11,12. Il est recommandé que les milieux de culture bactérienne soient exempts de suppléments de croissance contenant des composants contenant du VE ou des composants protéiques, tels que l’albumine oléique dextrose catalase (OADC) et de détergents tels que Tween. Il est également recommandé de dépister la qualité de la culture bactérienne et la CFP récoltée afin d’assurer une mort cellulaire et une lyse limitées^13,14.

1. Préparez un filtre centrifuge à coupure de poids moléculaire (MWCO) de 100 kDa (voir tableau des matériaux) en ajoutant la capacité de volume totale de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS). Centrifuger pendant 5 min à 2 800 x g à 4 °C.
   REMARQUE: Si vous utilisez un filtre sans volume d’arrêt mort, il faut veiller à ce que le volume de l’échantillon ne diminue pas en dessous du niveau du filtre, ce qui entraîne un séchage complet du filtre pendant la centrifugation.
2. Jetez le fluide et tout PBS restant avant de remplir la chambre d’échantillonnage avec Mtb CFP à sa capacité maximale. Centrifuger à 2 800 x g à 4 °C jusqu’à ce que le volume soit réduit au volume minimal du dispositif d’ultrafiltration. Répétez l’opération au besoin, en ajoutant plus de CFP à l’unité jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été suffisamment réduit.
   REMARQUE: Conserver une partie du matériau d’écoulement de 100 kDa (100F) pour la qualification en aval si vous le souhaitez. Conserver à 4 °C.
3. Ajoutez 1x PBS à l’unité de filtration contenant le concentré jusqu’à la capacité totale de l’appareil. Réduisez le volume comme décrit à la section 1.2. Répétez cette étape cinq fois pour assurer un lavage complet et un échange de tampon.
4. Récupérer le rétentat CFP concentré de 100 kDa (100R) selon les spécifications du dispositif d’ultrafiltration (voir tableau des matériaux). Une fois le 100R récupéré, lavez le filtre avec un volume minimal de 1x PBS au moins trois fois, et regroupez le lavage avec le 100R pour maximiser la récupération.
5. Quantifier le matériau 100R avec un test bicinchoninique (BCA) en suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Pour effectuer le test, utilisez plusieurs dilutions d’échantillons 1:2, 1:5 et 1:10 dans PBS. Testez l’échantillon en trois exemplaires.
   REMARQUE: Conservez une partie du matériau 100R pour la qualification en aval si vous le souhaitez. Conserver à 4 °C.

2. Chromatographie d’exclusion de taille pour l’enrichissement des VE Mtb à partir de CFP

REMARQUE: La procédure suivante est spécifique à l’utilisation de 3 mg de CFP 100R Mtb avec colonne SEC et collecteur de fraction automatique (AFC, voir Tableau des matériaux). Il peut être adapté à d’autres concentrations de départ et types de colonnes en suivant les spécifications du fabricant. En outre, il est recommandé aux utilisateurs de lire et de comprendre le manuel d’utilisation du collecteur automatique de fractions.

1. Laissez la colonne SEC s’équilibrer à la température ambiante.
2. Allumez l’AFC à l’aide de l’interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de l’unité tour et ajustez les paramètres du capteur de pesage, si nécessaire, en appuyant sur SETUP sur l’écran tactile du menu principal. Le capteur de pesage ne doit être étalonné qu’à la première utilisation, après chaque mise à jour logicielle et si une incohérence dans les volumes de collecte de fractions est remarquée.
3. Dans l’écran SETUP , alignez le carrousel en sélectionnant CAROUSEL > CALIBRATE. Insérez le carrousel avec les 13 petits trous tournés vers le haut dans la tour AFC et ajustez le carrousel de sorte que la buse de fluide soit directement au-dessus de la position de rinçage en appuyant sur les boutons - et / ou + .
4. Retirez les majuscules de la colonne SEC équilibrée. Faites glisser la colonne SEC dans le support de colonne approprié et installez-la soigneusement sur la tour AFC. Assurez-vous que l’étiquette d’identification par radiofréquence (RFID) sur la colonne fait face à l’AFC et vérifiez que la connexion entre la colonne et la vanne est sécurisée. Placez le tube de sortie des déchets dans un récipient de collecte.
5. Dans l’écran SETUP , sélectionnez Planification de la collecte et définissez le nombre sur 13 et la taille sur 0,5 mL en appuyant sur les boutons - et/ou + . Laissez le paramètre « Volume de la mémoire tampon » par défaut de 2,7 mL, puis fermez la fenêtre « Planification de la collecte » en appuyant sur X.
6. Sélectionnez START COLLECTION dans l’écran d’accueil et confirmez les paramètres de collection en sélectionnant OUI. Chargez 13 tubes de microcentrifugation étiquetés de 1,7 mL avec les couvercles ouverts et pointant vers le centre du carrousel.
7. Avancez l’AFC en sélectionnant OK, puis montez le réservoir de colonne et avancez à nouveau en appuyant sur OK. Sélectionnez l’option permettant de vider la colonne en appuyant sur OUI et ajoutez un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 μm pour supprimer tout tampon de stockage. Une fois le rinçage terminé, avancez l’AFC en appuyant sur OK.
8. Placez le capot du carrousel sur l’AFC et appuyez sur OK. Préparer un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 μm. Utilisez une pipette pour éliminer tout excès de tampon de la colonne.
9. Apporter 3 mg d’échantillon 100R tel que quantifié à l’étape 1,5 à 500 μL avec 1x PBS. Ajouter l’échantillon de 3 mg en haut de la colonne. Avancez l’AFC et laissez l’échantillon couler dans la fritte. Une fois que l’échantillon est complètement entré dans la colonne, ajoutez le PBS préparé à l’étape 2.6 au réservoir.
10. Surveillez l’exécution de l’AFC pendant qu’il collecte d’abord le volume de vide, puis les fractions spécifiées. Une fois la course terminée et le carrousel remis en position de déchet, retirez le couvercle et retirez les tubes de fraction du carrousel. Conserver les fractions à 4 °C avant la quantification (étape 3) et la qualification (étape 4).
11. Si la colonne doit être réutilisée, sélectionnez l’option permettant de nettoyer la colonne en appuyant sur OUI ; sinon, appuyez sur NON. Suivez les instructions sur l’AFC.
    REMARQUE: Une fois que la colonne est lavée et que le tampon de stockage est passé, il peut être retiré, bouché et stocké à 4 ° C.

3. Quantification des VTT

1. Mesurez la concentration en protéines pour chaque fraction à l’aide de BCA et de micro BCA¹².
   1. Pour les fractions de 0,5 mL prélevées sur 3 mg de 100R Mtb CFP, utilisez le micro BCA avec une dilution de 1:3 pour les fractions numérotées 1-7 de chaque échantillon en triple exemplaire.
   2. Pour les fractions de 0,5 mL numérotées de 5 à 13, utilisez le BCA sans dilution pour chaque échantillon en triple.
      REMARQUE: Le chevauchement des tests pour les fractions 5 à 7 aidera à s’assurer que toutes les fractions ont une sortie lisible.
2. Quantifiez la concentration de particules pour chaque fraction à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA).
   1. Diluer les échantillons dans 1 mL de 1x PBS en utilisant les rapports de départ suggérés suivants; pour les fractions 1 à 3, utilisez 1:100, puis pour les fractions restantes, utilisez une dilution 1:10.
   2. Vortex les solutions diluées, puis prélever l’échantillon dans une seringue jetable de 1 mL. Placez la seringue dans une pompe à seringue automatique si disponible.
   3. Réglez la pompe à seringue sur 30 μL/min et utilisez les paramètres de capture vidéo avec un gain d’écran de 10-12 et un niveau de caméra de 10-12. Ajustez la mise au point pour chaque échantillon.
   4. Collectez un minimum de trois vidéos à 30 s chacune en utilisant un flux constant.
   5. Effectuez l’analyse avec le seuil de détection logicielle défini sur cinq.
      REMARQUE: Il peut ne pas être possible d’obtenir des données NTA pour les dernières fractions (>7) sans sacrifier un volume d’échantillon significatif.

4. Qualification des véhicules électriques VTT

1. Visualisez le profil protéique général de chaque fraction à l’aide d’un gel protéique coloré à l’argent.
   REMARQUE : Les procédures détaillées pour la FDS-PAGE et la teinture d’argent se trouvent dans la référence¹⁵.
   1. Ajouter un tampon d’échantillon SDS à 10 μL de chaque fraction et 5 μg de CFP, 100R et 100F. Faire bouillir pendant 5 min à 100 °C, puis charger sur un gel Bis-Tris à 4% -12% avec une échelle de poids moléculaire pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) (voir Tableau des matériaux).
   2. Faites fonctionner le gel à l’aide de 1 tampon d’acide 2-[N-morpholino]éthanesulfonique (MES) (voir tableau des matériaux) et d’un courant de 200 V pendant 35 min.
   3. Retirez le gel de la cassette et procédez à la coloration à l’argent¹⁵.
2. Évaluer la présence ou l’absence de marqueurs EV dans chaque fraction par transfert Western.
   REMARQUE : Les procédures détaillées pour le transfert Western se trouvent dans la référence¹⁵.
   1. Exécutez un gel SDS-PAGE comme décrit aux étapes 4.1.1 à 4.1.2.
   2. Retirer le gel de la cassette et transférer les protéines résolues dans une membrane de nitrocellulose de 0,2 μm (voir tableau des matériaux) en appliquant un courant de 50 V pendant au moins 1 h.
   3. Effectuer une analyse western blot pour évaluer les protéines d’intérêt. Les anticorps primaires contre la LpqH, le lipoarabinomannane (LAM) et le GroES (voir tableau des matériaux) sont recommandés.
   4. Fractions de pool basées sur la présence ou l’absence de marqueurs applicables à l’application en aval.
3. Confirmer la présence de vésicules intactes par microscopie électronique à transmission (TEM).
   1. Fixer 15 μL de l’échantillon de vésicule en ajoutant 15 μL de paraformaldéhyde de qualité EM à 4 % et conserver à 4 °C pendant la nuit.
   2. Préparez une grille TEM en cuivre revêtue de carbone de 200 mailles en nettoyant la surface et en fabriquant un substrat hydrophile.
      REMARQUE: Un nettoyage au plasma avec 95% d’argon, 5% d’oxygène et 30% de puissance plasma pendant 1 min est recommandé.
   3. Déposer 10 μL de l’échantillon fixe sur la grille et laisser l’échantillon adhérer pendant 10 min, puis éponger l’excès de liquide avec du papier filtre.
   4. Faites flotter la grille sur une goutte d’eau ultrapure pendant 30 s, puis épongez l’excès de liquide.
   5. Faites flotter la grille sur une goutte d’acétate d’uranyle de qualité d% EM pendant 2 min, puis épongez l’excès de liquide.
   6. Laissez la grille sécher complètement à l’air.
   7. Image utilisant un TEM (voir tableau des matériaux) à 100 kV ou similaire.
      REMARQUE : D’autres méthodes de quantification et de caractérisation des VE devraient être utilisées en fonction des applications en aval. L’Information minimale pour les études des vésicules extracellulaires¹⁸ devrait être consultée pour obtenir des lignes directrices afin d’assurer la rigueur et la reproductibilité de toutes les études sur les VE.

La protéine de filtrat de culture (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a été concentrée, quantifiée, puis 3 mg de matériau ont été appliqués sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Les concentrations de protéines et de particules ont été dénombrées par BCA et NTA, respectivement. Les fourchettes attendues pour la récupération des protéines et des particules ainsi que les valeurs exactes obtenues pour ces résultats sont indiquées dans le tableau 1. Des valeurs beaucoup plus élevées que ces plages peuvent indiquer des problèmes de contamination ou d’intégrité des colonnes. Des valeurs significativement plus basses indiquent des problèmes dans les étapes d’ultrafiltration, et donc le débit doit être comparé à la CFP de départ et au 100R pour déterminer si une concentration réussie s’est produite. Une coloration d’argent protéique non spécifique montre que les fractions ultérieures contiennent plus de protéines et ressemblent au matériau 100R (Figure 1).

Les transferts occidentaux des fractions démontrent que le lipoarabinomannane (LAM) est présent dans toutes les fractions, les fractions ultérieures montrant des bandes d’intensité plus faibles (figure 2A, figure supplémentaire 1). La lipoprotéine LpqH de 19 kDa, connue pour être présente dans les MV^{Mtb 3,19}, est enrichie dans les premières fractions de la SEC (Figure 2B, Figure supplémentaire 1). La protéine de chaperonine GroES de 10 kDa est absente dans les premières fractions de la SEC (Figure 2C, Figure supplémentaire 1); cette constatation s’aligne sur les études publiées précédemment concernant GroES en tant que contaminant lors de l’enrichissement¹² des VTT EV et sert de contrôle négatif de la présence de Mtb EV. La microscopie électronique à transmission (TEM) confirme la présence de vésicules fermées liées à la membrane (figure 3A). Une comparaison des VE VTT séparés par ultrafiltration par gradient de densité et de cette méthode SEC est présentée dans le tableau 2. Sec fournit une récupération plus élevée des protéines et des particules pour trois répliques techniques à partir de la même CFP. Ces résultats ont été cohérents sur plusieurs lots de CFP (données non présentées). Les deux méthodes donnent des vésicules fermées liées à la membrane dans la plage de taille attendue, comme le démontrent la TEM (figure 3) et la NTA (figure 4).

Dans l’ensemble, ces données démontrent l’enrichissement des véhicules électriques VTT dans les premières fractions secs. Les valeurs de NTA les plus élevées se produisent dans les fractions 1 à 3, et la teneur en protéines augmente à mesure que le nombre de fractions augmente, ce qui indique la séparation des protéines solubles des VE (tableau 1). Étant donné que la fraction 4 contient des preuves de GroES (Figure 2C, Figure supplémentaire 1), cette fraction n’a pas été incluse dans le matériel groupé pour la GDT. Selon l’application en aval, l’inclusion ou l’exclusion de fractions spécifiques pour la stratégie de mise en commun doit être envisagée.

Figure 1 : Tache d’argent par fraction. Un gel SDS-PAGE coloré avec de l’argent démontre le profil protéique global pour chaque fraction. CFP = 5 μg de Mtb CFP, 100R = 5 μg de 100R, 100F = 5 μg de 100F, 1-11 = 10 μL de fractions SEC 1-11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Transferts de Western par fraction. Western blots détectant (A) LAM, (B) LpqH et (C) GroES, démontrant des changements de marqueurs protéiques à travers les fractions. CFP = 5 μg de Mtb CFP, 100R = 5 μg de 100R, 100F = 5 μg de 100F, 1-11 = 10 μL de fractions SEC 1-11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images de microscopie électronique à transmission (TEM). (A) Fractions SEC 1 à 3 regroupées avant la fixation. (B) L’ultracentrifugation du gradient de densité des véhicules électriques VTT a été colorée négativement pour l’imagerie TEM. Barres d’échelle = 200 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Distribution de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). (A) Fractions SEC 1-3. (B) Les véhicules électriques Mtb d’ultracentrifugation à gradient de densité ont été analysés avec une analyse de suivi des nanoparticules. La distribution de taille s’affiche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Récupération des protéines et des particules par fraction. Plage de récupération attendue des protéines et des particules par fraction sur la base de 3 mg de matière première. Les valeurs exactes pour obtenir le matériel utilisé dans cette étude sont incluses dans les deux colonnes les plus à droite.

Tableau 2 : Comparaison des méthodes de récupération des protéines et des particules. Rendement protéique mesuré avec BCA et nombre total de particules mesuré par NTA pour les VE Mtb provenant de 3 mg de la même matière première 100R, enrichie à l’aide de la méthode d’ultracentrifugation à gradient de densité^{référencée 8 ou de} cette méthode SEC (triplicate).

Figure supplémentaire 1 : Transferts Occidentaux d’origine (non recadrés) de la figure 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis sont des réservoirs hautement antigéniques, ce qui les présente comme une avenue attrayante pour le développement d’outils de diagnostic et de futurs vaccins ^4,19,20. Historiquement, l’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour séparer les VÉHICULES VTT d’autres matériaux solubles et sécrétés⁸. Bien que ce processus soit efficace, il prend également beaucoup de temps, est techniquement difficile et peut avoir un impact sur l’intégrité des préparations de VE résultantes ^9,10. Le protocole présenté offre une méthode alternative pour les préparations Mtb EV par chromatographie d’exclusion de taille (SEC).

Il y a plusieurs points critiques pour réussir dans cette méthode. La préparation initiale de Mtb CFP influencera la qualité et le rendement des vésicules après la SEC. Il est recommandé de récolter la PCP au milieu de la phase logarithmique de croissance ou avant cette phase afin de limiter le niveau de lyse cellulaire au moment de la récolte. Les cultures en phase de croissance tardive et stationnaire peuvent contenir des niveaux plus élevés de lyse cellulaire et peuvent entraîner l’identification de protéines intracellulaires et de structures artifactuelles de type EV, générées spontanément à partir des fragments membranaires des cellules lysées, en tant que contributeur significatif à la CFP^collectée 12,13,14 . Cela devrait être évalué avant de commencer ce protocole, car les vésicules membranaires des cellules lysées co-purifieront avec les VE Mtb sécrétés et les analyses en aval potentiellement biaisées. Des précautions doivent être prises pendant l’ultrafiltration pour s’assurer que la membrane filtrante reste intacte et humide. Les dommages au filtre peuvent provoquer l’écoulement du matériau souhaité. L’inclusion de la PCP originale, 100R et 100F sur les évaluations de la qualité en aval aidera à l’évaluation de l’intégrité de l’ultrafiltration.

Une configuration et un lavage appropriés de la colonne SEC sont nécessaires pour une préparation EV de la plus haute qualité. Suivez toujours les manuels d’utilisation pour la configuration et le retrait. Pendant que les fractions sont collectées, assurez-vous que l’AFC n’est pas heurté ou déplacé, car cela pourrait interrompre le processus et entraîner des fractions sautées ou incohérentes. Les anticorps utilisés pour la qualification dépendront de l’application en aval des vésicules enrichies et devraient inclure un marqueur qui devrait se trouver dans les VE MTB (LpqH) et un marqueur trouvé dans la PCP mais non enrichi dans les VEM (GroES). L’une des limites des méthodes présentées ici est la variation potentielle des contrôles appropriés des protéines. Ce protocole a été développé en utilisant des méthodes de culture standard. Les travaux effectués avec Mycobacterium avium ont suggéré que les niveaux de chaperonines comme GroES changent dans la PCP et les VE en fonction du milieu utilisé pour la croissance²¹. Au fur et à mesure que de plus amples informations émergent concernant la composition mycobactérienne de VE, il peut être nécessaire d’ajuster le marqueur de contrôle négatif spécifique.

Enfin, toutes les procédures de quantification et de qualification et les applications en aval doivent être effectuées rapidement. Si un entreposage du matériel est nécessaire, il est recommandé de congeler 4 °C pour éviter toute perturbation de l’intégrité des vésicules pendant le processus de congélation-décongélation. Si la congélation est effectuée, aliquotez le matériau pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Les véhicules électriques enrichis devraient être réévalués à la fois quantitativement et qualitativement si un laps de temps important s’écoule entre l’évaluation initiale et l’utilisation.

Cette méthode enrichit efficacement les VE VTT, et il existe une flexibilité pour l’adaptation à d’autres mycobactéries. Lors de l’adaptation de cette procédure à d’autres organismes, assurez-vous que la culture de départ a une lyse cellulaire limitée. La quantité de matériau chargée sur la colonne doit être ajustée, car la cinétique de libération des VE variera. Ne pas dépasser une concentration maximale en protéines de 7 g par 100 mL selon les spécifications du fabricant. Il est également nécessaire d’évaluer chaque fraction individuellement pour la présence de marqueurs et de contaminants associés aux VE. Les données sur la concentration en protéines et la NTA peuvent être trompeuses dans l’optimisation de la méthode : une très faible concentration en protéines ne signifie pas l’absence de vésicules dans ces fractions. En outre, la modification des colonnes SEC et des paramètres de collecte de fractions permet à l’utilisateur de mettre à l’échelle le protocole en fonction des applications d’entrée et en aval. Les limites de cette méthode comprennent le coût de l’AFC et des consommables, la production diluée et, comme mentionné précédemment, le développement et l’optimisation du schéma de mise en commun des factions. Alors que l’ultracentrifugation à gradient de densité a ses avantages et peut-être plus applicable pour certaines expériences, l’enrichissement des véhicules électriques VTT par SEC est comparable en qualité et supérieur en termes d’accès et de facilité d’utilisation, comme présenté ici.