Summary

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho

Published: May 19, 2022
doi:

Summary

Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.

Abstract

O papel das vesículas extracelulares (EVs) no contexto da infecção bacteriana surgiu como um novo caminho para a compreensão da fisiologia microbiana. Especificamente, os EVs Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempenham um papel na interação hospedeiro-patógeno e na resposta ao estresse ambiental. Os EVs Mtb também são altamente antigênicos e mostram potencial como componentes de vacinas. O método mais comum para purificar EVs Mtb é a ultracentrifugação gradiente de densidade. Esse processo tem várias limitações, incluindo baixo rendimento, baixo rendimento, dependência de equipamentos caros, desafios técnicos, podendo impactar negativamente a preparação resultante. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é um método alternativo mais suave que combate muitas das limitações da ultracentrifugação. Este protocolo demonstra que a SEC é eficaz para o enriquecimento de EV Mtb e produz preparações de EV Mtb de alta qualidade de maior rendimento de forma rápida e escalável. Além disso, uma comparação com a ultracentrifugação de gradiente de densidade por procedimentos de quantificação e qualificação demonstra os benefícios da SEC. Enquanto a avaliação da quantidade de EV (análise de rastreamento de nanopartículas), fenótipo (microscopia eletrônica de transmissão) e conteúdo (mancha ocidental) é adaptado para EVs Mtb, o fluxo de trabalho fornecido pode ser aplicado a outras micobactérias.

Introduction

A liberação de vesícula extracelular (EV) por patógenos pode ser a chave para desbloquear novas tecnologias para controlar doenças infecciosas1. A micobacterium tuberculosis (Mtb) é um patógeno de alta consequência, infectando aproximadamente um terço da população mundial e reivindicando a vida de milhões de pessoas a cada ano2. A produção de EV por Mtb é bem documentada, mas evasiva nos papéis biogêneses e variados (ou seja, imunoestimulatório, imunossupressor, aquisição de ferro e nutrientes) desses EVs no contexto da infecção 3,4,5. Os esforços para entender a composição dos EVs Mtb revelaram esferas lipídicas de 50-150 nm de membrana lipídica derivadas da membrana plasmática contendo lipídios e proteínas de significância imunológica 3,6. A investigação do papel dos EVs de Mtb na fisiologia bacteriana revelou a importância da modulação bacteriana de EV em resposta ao estresse ambiental para a sobrevivência5. Estudos de interação hospedeiro-patógeno têm sido mais complicados de interpretar, mas evidências indicam que os EVs Mtb podem influenciar a resposta imune do hospedeiro e podem potencialmente servir como um componente de vacinação eficaz 3,4,7.

A maioria dos estudos de EVs Mtb até agora tem se apoiado na ultracentrifugação gradiente de densidade para o enriquecimento vesícula8. Isso tem sido eficaz para estudos de pequena escala; no entanto, essa técnica tem diversos desafios técnicos e logísticos. Fluxos de trabalho alternativos casam centrifugação multistep, para a remoção de células inteiras e detritos grandes, com um passo final de ultracentrifugação para eVs de pelotização. Essa metodologia pode variar em eficiência, e muitas vezes resulta em baixo rendimento e co-purificação de biomoléculas não vesículas solúveis associadas, ao mesmo tempo em que impacta a integridade vesícula9. Além disso, esse processo é demorado, manualmente intensivo e muito limitado em rendimento devido a restrições de equipamentos.

O presente protocolo descreve uma técnica alternativa à ultracentrifugação gradiente de densidade: cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Este método tem sido demonstrado para micobactérias ambientais, e no trabalho atual, foi extrapolado para Mtb10. Uma coluna comercialmente disponível e coletor de frações automática pode melhorar a consistência na preparação vesical e reduzir a necessidade de equipamentos específicos e caros. Também é possível completar este protocolo em uma fração do tempo em comparação com a ultracentrifugação gradiente de densidade, aumentando o throughput. Esta técnica é menos tecnicamente desafiadora, facilitando o domínio, e pode aumentar a reprodutibilidade inter/intra-laboratorial. Finalmente, a SEC tem alta eficiência de separação e é gentil, preservando a integridade das vesículas.

Protocol

O Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade estadual do Colorado aprovou o presente estudo (19-046B). O cultivo de Mycobacterium tuberculosis e a colheita de supernacantes culturais ricos em EV foram realizados por pessoal treinado em um laboratório de alta contenção. Os materiais foram retirados da área de alta contenção após a realização de um método de inativação válido, confirmado e aprovado por políticas institucionais de biossegurança. Ao replicar o protocolo, se a inativação…

Representative Results

A proteína filtrada de cultura (PCC) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi concentrada, quantificada e, em seguida, 3 mg de material foi aplicado a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). As concentrações de proteínas e partículas foram enumeradas por BCA e NTA, respectivamente. As faixas esperadas para recuperação de proteínas e partículas mais os valores exatos obtidos para esses resultados são relatados na Tabela 1. Valores muito superiores a essas faixas podem …

Discussion

As vesículas extracelulares de micobacterium tuberculosis são reservatórios altamente antigênicos, que os apresentam como um caminho atraente para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e vacinas futuras 4,19,20. Historicamente, a ultracentrifugação de gradiente de densidade tem sido usada para separar EVs Mtb de outros materiais solúveis e secretos8. Embora esse processo seja ef…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de reconhecer o apoio do Prêmio Experiencial de Medicina Veterinária e Ciências Biomédicas e do Conselho de Pesquisa Universitária ao NKG e financiamento da ATCC (prêmio nº 2016-0550-0002) ao KMD. Também gostaríamos de reconhecer Anne Simpson por suporte técnico e recursos BEI, NIAID, NIH para os seguintes reagentes: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produzido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produzido in vitro), NR-49223, e Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produzido in vitro), NR-13811.

Materials

20x MES SDS Running Buffer ThermoFisher Scientific NP0002
96 well plate Corning 15705-066
Automatic Fraction Collector IZON Science AFC-V1-USD
BenchMark Pre-stained Protein Ladder Invitrogen 10748010
Benchtop centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R
Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff Millipore Sigma UFC710008 Ultrafiltration device used in step 1.1
Electroblotting System ThermoFisher Scientific 09-528-135
EM Grade Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids Electron Microscopy Sciences FCF200H-Cu-TA
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL AbCam ab6790 Secondary antibody
JEM-1400 Transmission Electron Microscope JOEL
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Microplate reader BIOTEK Epoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) BEI Resources NR-49223 Primary antibody
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) BEI Resources NR-13792 Primary antibody
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 BEI Resources NR-13811 Primary antibody
NanoClean 1070 Fischione Instruments For plasma cleaning of the TEM grid
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software Malvern Panalytical NS300
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm BioRad 1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels ThermoFisher Scientific NP0323BOX
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium Corning 21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050
qEV Original 35 nm 5/pk IZON Science SP5-USD SEC column
SDS sample buffer Boster AR1112 In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent
SDS-PAGE gel chamber ThermoFisher Scientific EI0001
Sigmafast BCIP/NBT Millipore Sigma B5655
Silver Stain Plus Kit BioRad 1610449 In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400

References

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Cite This Article
Ryan, J. M., Dobos, K. M., Kruh-Garcia, N. A. Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography. J. Vis. Exp. (183), e63895, doi:10.3791/63895 (2022).

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