Прямое сравнение гиперспектрального стимулированного рамановского рассеяния и когерентной рамановской микроскопии против Стокса для химической визуализации

Явление комбинационного рассеяния впервые наблюдалось в 1928 году К. В.^{Раманом 1}. Когда падающий фотон взаимодействует с образцом, может спонтанно произойти событие неупругого рассеяния, при котором изменение энергии фотона соответствует вибрационному переходу анализируемых химических веществ. Этот процесс не требует использования химической метки, что делает его универсальным инструментом для химического анализа без этикеток, сводя к минимуму возмущение образца. Несмотря на свои преимущества, спонтанное комбинационное рассеяние страдает от низкого поперечного сечения рассеяния (обычно 10¹¹ ниже, чем инфракрасное [ИК] поперечное сечение поглощения), что требует длительного времени получения для анализа². Таким образом, стремление повысить чувствительность процесса рамановского рассеяния имеет важное значение для продвижения рамановских технологий для визуализации в режиме реального времени.

Одним из эффективных способов значительного повышения чувствительности комбинационного рассеяния являются когерентные процессы комбинационного рассеяния (CRS), для которых обычно используются два лазерных импульса для возбуждения молекулярных колебательных переходов ^3,4. Когда разность энергии фотонов между двумя лазерами соответствует колебательным модам молекул образцов, будут генерироваться сильные рамановские сигналы. Двумя наиболее часто используемыми процессами CRS для визуализации являются когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS)⁵. За последние два десятилетия технологические разработки продвинули методы микроскопии CARS и SRS, чтобы стать мощными инструментами для количественной оценки без маркировки и выяснения химических изменений в биологических образцах.

Химическая визуализация с помощью микроскопии CARS может быть датирована 1982 годом, когда лазерное сканирование было впервые применено для получения изображений CARS, продемонстрированных Duncan et al⁶. Модернизация микроскопии CARS была значительно ускорена после широкого применения лазерной сканирующей многофотонной флуоресцентной микроскопии⁷. Ранняя работа группы Xie с использованием лазеров с высокой частотой повторения превратила CARS в высокоскоростную, без маркировки, химическую платформу визуализации для характеристики молекул в биологических образцах ^8,9,10. Одной из основных проблем для визуализации CARS является наличие нерезонансного фона, который снижает контрастность изображения и искажает рамановский спектр. Было предпринято много усилий, чтобы либо уменьшить нерезонансный фон 11,12,13,14,15, либо извлечь резонансные рамановские сигналы из спектров CARS ^16,17. Еще одним достижением, которое значительно продвинуло эту область, является гиперспектральная визуализация CARS, которая позволяет осуществлять спектральное отображение на каждом пикселе изображения с улучшенной химической селективностью 18,19,20,21.

Стимулированное рамановское рассеяние (SRS) является более молодой технологией визуализации, чем CARS, хотя она была обнаружена ранее^{22 года}. В 2007 году сообщалось о микроскопии SRS с использованием лазерного источника²³ с низкой частотой повторения. Вскоре несколько групп продемонстрировали высокоскоростную визуализацию SRS с использованием лазеров с высокой частотой повторения 24,25,26. Одним из основных преимуществ микроскопии SRS перед CARS является отсутствие нерезонансного фона²⁷, хотя другие фоны, такие как кросс-фазовая модуляция (XPM), переходное поглощение (TA), поглощение двух фотонов (TPA) и фототермический (PT) эффект, могут возникать с SRS²⁸. Кроме того, сигнал SRS и концентрация образца имеют линейные отношения, в отличие от CARS, который имеет квадратичную зависимость сигнал-концентрация²⁹. Это упрощает химическую количественную оценку и спектральное размешивание. Многоцветная и гиперспектральная SRS развивалась в различных формах 30,31,32,33,34,35,36, причем спектральная фокусировка является одним из самых популярных подходов для химической визуализации ^37,38.

Как CARS, так и SRS требуют фокусировки накачки и лазерных лучей Стокса на образец, чтобы соответствовать вибрационному переходу молекул для возбуждения сигнала. Микроскопы CARS и SRS также имеют много общего. Однако физика, лежащая в основе этих двух процессов, и обнаружение сигналов, участвующих в этих технологиях микроскопии, имеют различия ^3,39. CARS представляет собой параметрический процесс, который не имеет чистой энергетической связи фотон-молекула³. SRS, однако, является непараметрическим процессом и способствует передаче энергии между фотонами и молекулярными системами²⁷. В CARS генерируется новый сигнал на анти-Стоксовой частоте, в то время как SRS проявляется как передача энергии между накачкой и лазерными лучами Стокса.

Сигнал CARS удовлетворяет Eq (1)²⁸.

(1)

Между тем, сигнал SRS может быть записан как Eq (2)²⁸.

(2)

Здесь I_p, I s, I_CARS и ΔI_SRS — это интенсивности пучка насоса, луча Стокса, _{сигнала} CARS и сигналов SRS соответственно. χ⁽³⁾ — нелинейная оптическая восприимчивость образца третьего порядка, представляющая собой комплексное значение, состоящее из реальной и воображаемой частей.

Эти уравнения выражают спектральные профили и зависимость концентрации сигнала CARS и SRS. Различия в физике приводят к разрозненным схемам обнаружения для этих двух технологий микроскопии. Обнаружение сигнала в CARS обычно включает спектральное разделение вновь генерируемых фотонов и обнаружение с помощью фотоумножителя (PMT) или устройства с зарядовой связью (CCD); для SRS обмен энергией между насосом и пучками Стокса обычно измеряется высокоскоростной модуляцией интенсивности с использованием оптического модулятора и демодуляцией с использованием фотодиода (PD) в паре с блокирующим усилителем.

Хотя в последние годы было опубликовано много технологических разработок и приложений как в областях CARS, так и SRS, на одной и той же платформе не проводилось систематического сравнения двух методов CRS, особенно для гиперспектральной МИКРОСКОПИИ CARS и SRS. Прямые сравнения чувствительности, пространственного разрешения, спектрального разрешения и возможностей химического разделения позволят биологам выбрать наилучшую модальность для количественной оценки химических веществ. В этом протоколе приведены подробные шаги по созданию мультимодальной платформы визуализации с гиперспектральными модальностями CARS и SRS на основе фемтосекундной лазерной системы и спектральной фокусировки. Эти два метода были сопоставлены в прямом направлении для спектрального разрешения, чувствительности обнаружения, пространственного разрешения и контрастов изображений клеток.