مقارنة مباشرة بين تشتت رامان المحفز فوق الطيف ومجهر تشتت رامان المضاد للستوكس للتصوير الكيميائي

لوحظت ظاهرة تشتت رامان لأول مرة في عام 1928 من قبل C. V. Raman¹. عندما يتفاعل فوتون حادث مع عينة ، يمكن أن يحدث حدث تشتت غير مرن تلقائيا ، حيث يتطابق تغير طاقة الفوتون مع انتقال اهتزازي للأنواع الكيميائية التي تم تحليلها. لا تتطلب هذه العملية استخدام علامة كيميائية ، مما يجعلها أداة متعددة الاستخدامات وخالية من الملصقات للتحليل الكيميائي مع تقليل اضطراب العينات. على الرغم من مزاياه ، يعاني تشتت رامان التلقائي من مقطع عرضي منخفض التشتت (عادة 10¹¹ أقل من المقطع العرضي لامتصاص الأشعة تحت الحمراء [IR]) ، مما يتطلب أوقات اكتساب طويلة للتحليل². وبالتالي ، فإن السعي لزيادة حساسية عملية تشتت رامان أمر ضروري في دفع تقنيات رامان للتصوير في الوقت الفعلي.

إحدى الطرق الفعالة لتعزيز حساسية تشتت رامان بشكل كبير هي من خلال عمليات تشتت رامان المتماسكة (CRS) ، والتي تستخدم عادة نبضتان ليزر لإثارة التحولات الاهتزازية الجزيئية ^3,4. عندما يتطابق فرق طاقة الفوتون بين الليزرين مع الأوضاع الاهتزازية لجزيئات العينة ، سيتم توليد إشارات رامان قوية. عمليتا CRS الأكثر استخداما للتصوير هما تشتت رامان المضاد لستوكس (CARS) وتشتت رامان المحفز (SRS)⁵. على مدى العقدين الماضيين ، طورت التطورات التكنولوجية تقنيات الفحص المجهري CARS و SRS لتصبح أدوات قوية للقياس الكمي الخالي من الملصقات وتوضيح التغيرات الكيميائية في العينات البيولوجية.

يمكن تأريخ التصوير الكيميائي بواسطة الفحص المجهري CARS إلى عام 1982 عندما تم تطبيق المسح الضوئي بالليزر لأول مرة للحصول على صور CARS ، والتي أظهرها Duncan et al⁶. تم تسريع تحديث المجهر CARS بشكل كبير بعد التطبيقات الواسعة للمسح الضوئي بالليزر متعدد الفوتونات المجهرية^{الفلورية 7}. أدى العمل المبكر من مجموعة Xie باستخدام ليزر عالي معدل التكرار إلى تحويل CARS إلى منصة تصوير كيميائية عالية السرعة وخالية من الملصقات لتوصيف الجزيئات في العينات البيولوجية ^8,9,10. واحدة من القضايا الرئيسية لتصوير CARS هي وجود خلفية غير رنانة ، مما يقلل من تباين الصورة ويشوه طيف رامان. تم بذل العديد من الجهود إما لتقليل الخلفية غير الرنانة 11،^12،13،14،¹⁵ أو لاستخراج إشارات رامان الرنانة من أطياف CARS^16،17. التقدم الآخر الذي تقدم بشكل كبير في هذا المجال هو التصوير الفائق الطيف CARS ، والذي يسمح برسم الخرائط الطيفية في كل بكسل صورة مع تحسين الانتقائية الكيميائية¹⁸،^19،20،21.

تشتت رامان المحفز (SRS) هي تقنية تصوير أصغر سنا من CARS ، على الرغم من أنه تم اكتشافها في وقت سابق^{من 22}. في عام 2007 ، تم الإبلاغ عن الفحص المجهري SRS باستخدام مصدر ليزر منخفض معدل التكرار²³. سرعان ما أظهرت عدة مجموعات تصوير SRS عالي السرعة باستخدام ليزر عالي معدل التكرار^24،25،26. واحدة من المزايا الرئيسية للفحص المجهري SRS على CARS هي عدم وجود خلفية غير رنانة²⁷ ، على الرغم من أن الخلفيات الأخرى مثل التشكيل عبر الطور (XPM) ، والامتصاص العابر (TA) ، والامتصاص ثنائي الفوتون (TPA) ، وتأثير الحرارة الضوئية (PT) ، قد تحدث مع SRS²⁸. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إشارة SRS وتركيز العينة لهما علاقات خطية ، على عكس CARS ، التي تعتمد على تركيز الإشارة التربيعية²⁹. وهذا يبسط القياس الكمي الكيميائي وفك الخلط الطيفي. تطورت SRS متعددة الألوان وفائقة الطيف في أشكال مختلفة 30،³¹،^32،33،^34،35،36 ، مع التركيز الطيفي كونها واحدة من أكثر الأساليب شعبية للتصوير الكيميائي^37،38.

يتطلب كل من CARS و SRS تركيز المضخة وأشعة ليزر ستوكس على العينة لتتناسب مع الانتقال الاهتزازي للجزيئات لإثارة الإشارة. تشترك مجاهر CARS و SRS أيضا في الكثير من القواسم المشتركة. ومع ذلك ، فإن الفيزياء الكامنة وراء هاتين العمليتين ، واكتشافات الإشارات المشاركة في تقنيات الفحص المجهري هذه لها تفاوتات ^3,39. CARS هي عملية بارامترية لا تحتوي على اقتران طاقة صافي لجزيء الفوتون³. ومع ذلك ، فإن SRS هي عملية غير بارامترية ، وتساهم في نقل الطاقة بين الفوتونات والأنظمة الجزيئية²⁷. في CARS ، يتم إنشاء إشارة جديدة بتردد مضاد ل Stokes ، بينما يظهر SRS على أنه نقل الطاقة بين المضخة وأشعة ليزر Stokes.

إشارة CARS ترضي Eq (1)²⁸.

(1)

وفي الوقت نفسه ، يمكن كتابة إشارة SRS ك Eq (2) ²⁸.

(2)

هنا ، I _P و I _S و I CARS و ΔI_SRS هي شدة شعاع المضخة ، وشعاع ستوكس ، وإشارة _CARS ، وإشارات SRS ، على التوالي. χ⁽³⁾ هي القابلية البصرية غير الخطية من الدرجة الثالثة للعينة ، وهي قيمة معقدة تتكون من أجزاء حقيقية ووهمية.

تعبر هذه المعادلات عن الملامح الطيفية واعتماد تركيز الإشارة ل CARS و SRS. تؤدي الاختلافات في الفيزياء إلى مخططات كشف متباينة لهاتين التقنيتين المجهريتين. عادة ما ينطوي الكشف عن الإشارة في CARS على الفصل الطيفي للفوتونات التي تم إنشاؤها حديثا والكشف عنها باستخدام أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) أو جهاز مقترن بالشحنة (CCD) ؛ بالنسبة ل SRS ، عادة ما يتم قياس تبادل الطاقة بين المضخة وحزم Stokes عن طريق تعديل عالي السرعة باستخدام مغير بصري وإزالة الصبغة باستخدام صمام ثنائي ضوئي (PD) مقترن بمضخم صوت قفل.

على الرغم من نشر العديد من التطورات والتطبيقات التكنولوجية في السنوات الأخيرة في كل من مجالات CARS و SRS ، لم يتم إجراء مقارنات منهجية بين تقنيتي CRS على نفس النظام الأساسي ، خاصة بالنسبة ل CARS فائقة الطيف و SRS المجهرية. ومن شأن المقارنات المباشرة في الحساسية والدقة المكانية والدقة الطيفية وقدرات الفصل الكيميائي أن تسمح لعلماء الأحياء باختيار أفضل طريقة للقياس الكمي الكيميائي. في هذا البروتوكول ، يتم توفير خطوات مفصلة لبناء منصة تصوير متعددة الوسائط مع كل من طرائق CARS و SRS فائقة الطيف على أساس نظام ليزر الفيمتو ثانية والتركيز الطيفي. تمت مقارنة التقنيتين في الاتجاه الأمامي للدقة الطيفية ، وحساسية الكشف ، والدقة المكانية ، وتباينات التصوير للخلايا.