Direkter Vergleich der hyperspektralen stimulierten Raman-Streuung und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie für die chemische Bildgebung

Das Raman-Streuungsphänomen wurde erstmals 1928 von C. V. Raman¹ beobachtet. Wenn ein einfallendes Photon mit einer Probe interagiert, kann spontan ein inelastisches Streuereignis auftreten, bei dem die Energieänderung des Photons mit einem Schwingungsübergang der analysierten chemischen Spezies übereinstimmt. Dieser Prozess erfordert nicht die Verwendung eines chemischen Tags und ist somit ein vielseitiges, etikettenfreies Werkzeug für die chemische Analyse bei gleichzeitiger Minimierung der Probenstörung. Trotz ihrer Vorteile leidet die spontane Raman-Streuung unter einem geringen Streuquerschnitt (typischerweise 10¹¹ niedriger als der Infrarot-Absorptionsquerschnitt [IR]), was lange Erfassungszeiten für die Analyse^{erforderlich macht 2}. Daher ist das Bestreben, die Empfindlichkeit des Raman-Streuprozesses zu erhöhen, unerlässlich, um Raman-Technologien für die Echtzeit-Bildgebung voranzutreiben.

Eine effektive Möglichkeit, die Empfindlichkeit der Raman-Streuung erheblich zu erhöhen, sind kohärente Raman-Streuprozesse (CRS), für die typischerweise zwei Laserpulse verwendet werden, um molekulare Schwingungsübergänge^{anzuregen 3,4}. Wenn die Photonen-Energiedifferenz zwischen den beiden Lasern mit den Schwingungsmoden von Probenmolekülen übereinstimmt, werden starke Raman-Signale erzeugt. Die beiden am häufigsten verwendeten CRS-Verfahren für die Bildgebung sind kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und stimulierte Raman-Streuung (SRS)⁵. In den letzten zwei Jahrzehnten haben technologische Entwicklungen CARS- und SRS-Mikroskopietechniken zu leistungsfähigen Werkzeugen für die markierungsfreie Quantifizierung und Aufklärung chemischer Veränderungen in biologischen Proben gemacht.

Die chemische Bildgebung durch CARS-Mikroskopie kann auf das Jahr 1982 datiert werden, als Laserscanning zum ersten Mal angewendet wurde, um CARS-Bilder zu erfassen, demonstriert von Duncan et al⁶. Die Modernisierung der CARS-Mikroskopie wurde nach den breiten Anwendungen der Laser-Scanning-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie^{stark beschleunigt 7}. Frühe Arbeiten der Xie-Gruppe, die Laser mit hoher Wiederholungsrate verwenden, haben CARS zu einer schnellen, markierungsfreien, chemischen Bildgebungsplattform für die Charakterisierung von Molekülen in biologischen Proben^entwickelt 8,9,10. Eines der Hauptprobleme für die CARS-Bildgebung ist das Vorhandensein eines nicht resonanten Hintergrunds, der den Bildkontrast reduziert und das Raman-Spektrum verzerrt. Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um entweder den nicht resonanten Hintergrund 11,12,13,14,15 zu reduzieren oder resonante Raman-Signale aus den CARS-Spektren ^16,17 zu extrahieren. Ein weiterer Fortschritt, der das Feld stark vorangebracht hat, ist die hyperspektrale CARS-Bildgebung, die eine spektrale Kartierung an jedem Bildpixel mit verbesserter chemischer Selektivität 18,19,20,21 ermöglicht.

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine jüngere Bildgebungstechnologie als CARS, obwohl sie früher entdeckt wurde²². Im Jahr²⁰⁰⁷ wurde berichtet, dass die SRS-Mikroskopie eine Laserquelle mit niedriger Wiederholungsrate 23 verwendete. Bald demonstrierten mehrere Gruppen eine Hochgeschwindigkeits-SRS-Bildgebung mit Lasern mit hoher Wiederholungsrate^24,25,26. Einer der Hauptvorteile der SRS-Mikroskopie gegenüber CARS ist das Fehlen des nicht-resonanten Hintergrunds²⁷, obwohl andere Hintergründe wie Kreuzphasenmodulation (XPM), transiente Absorption (TA), Zwei-Photonen-Absorption (TPA) und photothermischer (PT) -Effekt bei SRS²⁸ auftreten können. Darüber hinaus haben das SRS-Signal und die Probenkonzentration lineare Beziehungen, im Gegensatz zu CARS, das eine quadratische Signalkonzentrationsabhängigkeit^{aufweist 29}. Dies vereinfacht die chemische Quantifizierung und spektrale Entmischung. Mehrfarbiges und hyperspektrales SRS hat sich in verschiedenen Formen^{entwickelt 30,31,32,33,34,35,36}, wobei die spektrale Fokussierung einer der beliebtesten Ansätze für die chemische Bildgebung ^{ist 37,38}.

Sowohl CARS als auch SRS erfordern die Fokussierung der Pumpe und der Stokes-Laserstrahlen auf die Probe, um den Schwingungsübergang der Moleküle für die Signalanregung anzupassen. Auch CARS und SRS-Mikroskope haben viel gemeinsam. Die Physik, die diesen beiden Prozessen zugrunde liegt, und die Signaldetektionen, die an diesen Mikroskopietechnologien beteiligt sind, weisen jedoch Disparitäten^{auf 3,39}. CARS ist ein parametrischer Prozess, der keine Netto-Photonen-Molekül-Energiekopplung^{hat 3}. SRS ist jedoch ein nichtparametrischer Prozess und trägt zum Energietransfer zwischen Photonen und molekularen Systemen bei²⁷. In CARS wird ein neues Signal bei Anti-Stokes-Frequenz erzeugt, während sich SRS als Energieübertragung zwischen der Pumpe und den Stokes-Laserstrahlen manifestiert.

CARS Signal erfüllt Eq (1)²⁸.

(1)

In der Zwischenzeit kann das SRS-Signal als Eq (2) ²⁸ geschrieben werden.

(2)

Hier sind I _p, I _s, I CARS und ΔI_SRS die Intensitäten des Pumpenstrahls, des Stokes-Strahls, des CARS-Signals bzw. der _SRS-Signale. χ⁽³⁾ ist die nichtlineare optische Suszeptibilität der Probe dritter Ordnung und ist ein komplexer Wert, der sich aus realen und imaginären Teilen zusammensetzt.

Diese Gleichungen drücken die Spektralprofile und die Signalkonzentrationsabhängigkeit von CARS und SRS aus. Unterschiede in der Physik führen zu unterschiedlichen Nachweisschemata für diese beiden Mikroskopietechnologien. Die Signaldetektion in CARS beinhaltet in der Regel die spektrale Trennung neu erzeugter Photonen und die Detektion mit einer Photomultiplierröhre (PMT) oder einem ladungsgekoppelten Gerät (CCD); Für SRS wird der Energieaustausch zwischen der Pumpe und Stokes-Strahlen normalerweise durch Hochgeschwindigkeitsintensitätsmodulation mit einem optischen Modulator und Demodulation mit einer Photodiode (PD) in Verbindung mit einem Lock-in-Verstärker gemessen.

Obwohl in den letzten Jahren viele technologische Entwicklungen und Anwendungen sowohl im CARS- als auch im SRS-Bereich veröffentlicht wurden, wurden keine systematischen Vergleiche der beiden CRS-Techniken auf derselben Plattform durchgeführt, insbesondere für die hyperspektrale CARS- und SRS-Mikroskopie. Direkte Vergleiche in Bezug auf Empfindlichkeit, räumliche Auflösung, spektrale Auflösung und chemische Trennfähigkeiten würden es Biologen ermöglichen, die beste Modalität für die chemische Quantifizierung auszuwählen. In diesem Protokoll werden detaillierte Schritte zum Aufbau einer multimodalen Bildgebungsplattform mit hyperspektralen CARS- und SRS-Modalitäten auf der Grundlage eines Femtosekundenlasersystems und einer spektralen Fokussierung bereitgestellt. Die beiden Techniken wurden in Vorwärtsrichtung für spektrale Auflösung, Detektionsempfindlichkeit, räumliche Auflösung und bildgebende Kontraste von Zellen verglichen.