Дактилоскопирование кардиолипина в лейкоцитах масс-спектрометрией для быстрой диагностики синдрома Барта

Синдром Барта (BTHS) является редким Х-сцепленным заболеванием, характеризующимся ранней кардиомиопатией, миопатией скелетных мышц, задержкой роста, нейтропенией, вариабельной дисфункцией митохондриальной дыхательной цепи и аномальной^{структурой} митохондрий ^1,2,3,4,5. BTHS имеет распространенность одного случая на миллион мужчин с в настоящее время менее 250 известными случаями во всем мире, хотя широко признано, что болезнь недодиагностирована ^2,6. BTHS является результатом мутаций потери функции гена Tafazzin (TAFAZZIN), локализованного в хромосоме Xq28.12 ^7,8, вызывающих недостаточное ремоделирование митохондриального фосфолипида кардиолипина (CL), процесс, который обычно приводит к высокосимметричному и ненасыщенному ациловому составу ^9,10. CL считается сигнатурным липидом митохондрий, где он является важным компонентом внутренней мембраны, жизненно важным для окислительного фосфорилирования (то есть митохондриального энергетического метаболизма), образования суперкомплексов, импорта белка и участвует в динамике митохондрий, митофагии и апоптозе 11,12,13,14,15,16 . При потере функции TAFAZZIN ремоделирование CL не удается и в митохондриях пациентов с BTHS возникают специфические аномалии фосфолипидов: зрелый уровень CL (CLm) снижается, в то время как повышаются уровни монолизокардиопина (MLCL) и изменяется состав CL ацила (т.е. незрелые виды CL, CLi). Это приводит к резкому увеличению соотношения MLCL/CL¹⁷.

Диагностика BTHS часто затруднена, так как расстройство представляет собой чрезвычайно изменчивые клинические и биохимические особенности и может отличаться между пострадавшими лицами из одной семьи и внутри пациента с течением^{времени 3,5}. Многие мальчики BTHS показывают очень высокий уровень экскреции с мочой 3-метилглутаконовой кислоты (3-MGCA), но уровень мочи может быть нормальным или только слегка увеличиваться у пациентов с течением времени³. Тем не менее, увеличение 3-MGCA является особенностью различных других митохондриальных и немитохондриальных расстройств, таких как дефицит гидразы 3-метилглютаконил-КоА (дефект AUH), 3-метилглутаконовая ацидурия, дистония-глухота, энцефалопатия, синдром Ли (MEGDEL), синдром Костеффа и дилатационная кардиомиопатия с атаксией (DCMA)^{синдром 18,19} . Следовательно, плохая специфичность 3-MCGA как маркера BTHS и огромная вариабельность у пациентов делают биохимический диагноз неоднозначным.

Кроме того, было описано более 120 различных мутаций TAFAZZIN, вызывающих расстройство⁵ , и, следовательно, генетический диагноз может быть сложным, медленным и дорогостоящим. Более того, молекулярный анализ гена TAFAZZIN может привести к ложноотрицательным результатам при наличии мутаций в некодирующих или регулирующих последовательностях³. BTHS может быть однозначно проверен путем определения относительных количеств и распределения (монолизо-)видов CL и подтвержден секвенированием гена TAFAZZIN или наоборот.

Практическим тестом для диагностики является измерение соотношения MLCL/CL методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и анализа электрораспыляемой ионизации/масс-спектрометрии (ESI/MS) в пятне крови^20,21. Измерение уровня CL само по себе не является адекватным для диагностики, так как некоторые пациенты имеют почти нормальные уровни CL, но измененное соотношение MLCL / CL. Таким образом, измерение соотношения MLCL/CL имеет 100% чувствительность и специфичность для диагноза BTHS²¹. Другой проверенный метод, основанный на анализе ВЭЖХ и ESI / MS, был создан на лейкоцитах²², но сложные хроматографические методы разделения ранее извлеченных липидов и дороговизна инструментов ограничивают этот анализ несколькими клиническими лабораториями. Все эти факторы, вместе с отсутствием простого диагностического теста, способствовали недостаточной диагностике состояния.

MALDI-TOF/MS является еще одним валидным инструментом в анализе липидов^23,24. Этот аналитический метод может быть использован для непосредственного получения липидных профилей различных биологических образцов, пропуская таким образом этапы экстракции и разделения 25,26,27,28,29, в том числе в тканевых срезах для приложений MS Imaging ³⁰. Учитывая это преимущество, был разработан простой и быстрый метод диагностики BTHS путем профилирования митохондриального КЛ в интактных лейкоцитах с MALDI-TOF/MS²⁸. Выделение лейкоцитов всего из 1 мл цельной крови путем оседания и лизиса эритроцитов является простым и не требует специального оборудования или реагентов. Кроме того, был описан протокол быстрой липидной «мини-экстракции», применимый к мельчайшим количествам лейкоцитов, чтобы гарантировать успешное получение спектров, имеющих более чистые сигналы РС с более высоким отношением сигнал/шум (S/N), чем в спектрах, полученных из интактных лейкоцитов²⁸. Этот дальнейший шаг занимает мало времени и позволяет воспроизводить анализ даже при проведении на инструментах MS с низкой чувствительностью. Таким образом, аналитический метод, описанный здесь, требует минимальной пробоподготовки, поскольку трудоемкое и трудоемкое хроматографическое разделение липидов может быть пропущено, тем самым ускоряя тест.