טביעת אצבע קרדיוליפין בלוקוציטים על ידי ספקטרומטריית מסה לאבחון מהיר של תסמונת בארת
Summary
פרוטוקול זה מראה כיצד להשיג “טביעת אצבע” ספקטרומטרית מסה של קרדיולפין לויקוציטים לאבחון תסמונת בארת. ההערכה של יחס מונו-קרדיוקרדיוליפין גבוה לקרדיולפין מפלה חולים עם תסמונת בארת מחולי אי ספיקת לב מבוקרת עם רגישות וספציפיות של 100%.
Abstract
קרדיולפין (CL), פוספוליפיד דימרי הנושא ארבע שרשראות חומצות שומן במבנהו, הוא סמן השומנים של המיטוכונדריה, שם הוא ממלא תפקיד מכריע בתפקוד הממברנה הפנימית. המטבוליט המונוליזוקרדיוליפין שלו (MLCL) כמעט נעדר מבחינה פיזיולוגית בתמצית השומנים של תאי בעלי חיים והופעתו היא סימן ההיכר של תסמונת בארת (BTHS), מחלה גנטית נדירה ולעתים קרובות מאובחנת באופן שגוי הגורמת לקרדיומיופתיה חמורה בינקותה. השיטה המתוארת כאן מייצרת “טביעת אצבע קרדיוליפינית” ומאפשרת בדיקה פשוטה של הרמות היחסיות של מיני CL ו-MLCL בפרופילי השומנים התאיים. במקרה של לויקוציטים, רק 1 מ”ל של דם נדרש כדי למדוד את יחס MLCL/CL באמצעות יינון ספיגת לייזר בסיוע מטריצה – ספקטרומטריית זמן טיסה/מסה (MALDI-TOF/MS) רק תוך 2 שעות מגמילה מהדם. הבדיקה פשוטה וניתן לשלב אותה בקלות בעבודה השגרתית של מעבדה לביוכימיה קלינית לבדיקת BTHS. הבדיקה מראה רגישות וספציפיות של 100% עבור BTHS, מה שהופך אותה לבדיקת אבחון מתאימה.
Introduction
תסמונת בארת (BTHS) היא מחלה נדירה הקשורה ל-X המאופיינת בקרדיומיופתיה בשלב מוקדם, מיופתיה של שרירי השלד, עיכוב גדילה, נויטרופניה, תפקוד לקוי של שרשרת הנשימה המיטוכונדרית המשתנה ומבנה מיטוכונדריאלי לא תקין 1,2,3,4,5. ל-BTHS יש שכיחות של מקרה אחד למיליון גברים עם כיום פחות מ-250 מקרים ידועים ברחבי העולם, אם כי מקובל שהמחלה סובלת מתת-אבחוןשל 2,6. BTHS נובע ממוטציות של אובדן תפקוד של הגן Tafazzin (TAFAZZIN) המותאם לכרומוזום Xq28.12 7,8 הגורמים לשיפוץ לקוי של קרדיולפין הפוספוליפיד המיטוכונדריאלי (CL), תהליך שבדרך כלל מוביל להרכב אציל סימטרי ובלתי רווי מאוד 9,10. CL נחשבה לשומנים הבולטים של המיטוכונדריה, שם היא מרכיב חשוב של הממברנה הפנימית, חיונית לזרחון חמצוני (כלומר, חילוף חומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית), היווצרות סופר-קומפלקס, יבוא חלבונים, ומעורבת בדינמיקה מיטוכונדריאלית, מיטופגיה ואפופטוזיס 11,12,13,14,15,16 . לאחר אובדן התפקוד של TAFAZZIN, שיפוץ CL נכשל והפרעות ספציפיות בפוספוליפידים מתעוררות במיטוכונדריה של חולי BTHS: רמת CL בוגרת (CLm) יורדת, בעוד שרמות מוגברות של מונוליזוקרדיוליפין (MLCL) והרכב אציל CL שונה (כלומר, מיני CL לא בשלים, CLi) מתרחשים. זה מביא לעלייה דרמטית של יחס MLCL/CL17.
אבחון של BTHS הוא לעתים קרובות קשה, שכן ההפרעה מציגה תכונות קליניות וביוכימיות משתנות ביותר ועשויה להיות שונה בין אנשים מושפעים מאותה משפחה ובתוך המטופל לאורך זמן 3,5. נערי BTHS רבים מראים רמה גבוהה מאוד של הפרשת שתן של חומצה 3-מתיל-גלוטקונית (3-MGCA), אך רמת השתן עשויה להיות נורמלית או רק עלייה קלה בחולים לאורך זמן3. עם זאת, עלייה של 3-MGCA היא תכונה של הפרעות מיטוכונדריאליות ולא מיטוכונדריאליות אחרות, כגון מחסור ב-3-מתיל-גלוטקוניל-CoA הידרטאז (פגם AUH), חומצה 3-מתיל-גלוטקונית, דיסטוניה-חירשות, אנצפלופתיה, תסמונת דמוית לי (MEGDEL), תסמונת קוסטף וקרדיומיופתיה מורחבת עם תסמונת אטקסיה (DCMA)18,19 . לפיכך, הספציפיות הירודה של 3-MCGA כסמן ל- BTHS והשונות העצומה בחולים הופכות את האבחנה הביוכימית לעמומה.
יתר על כן, תוארו למעלה מ-120 מוטציות שונות של TAFAZZIN הגורמות להפרעה5 , ולכן אבחנה גנטית יכולה להיות מסובכת, איטית ויקרה. יתר על כן, ניתוח מולקולרי של הגן TAFAZZIN יכול להוביל לתוצאות שליליות כוזבות בנוכחות מוטציות ברצפים שאינם מקודדים או מווסתים3. ניתן לבדוק את BTHS באופן חד משמעי על ידי קביעת הכמויות היחסיות וההתפלגות של מיני CL (מונוליסו-) ומאושרים על ידי ריצוף גנים של TAFAZZIN או להיפך.
בדיקה מעשית לאבחון היא מדידת יחס MLCL/CL על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) וניתוח אלקטרו ריסוס יינון / ספקטרומטריית מסה (ESI/MS) בכתמי דם20,21. מדידת רמת CL לבדה אינה מספקת לאבחון מכיוון שלחלק מהמטופלים יש רמות כמעט נורמליות של CL אך יחס MLCL/CL שונה. לכן, למדידת יחס MLCL/CL יש 100% רגישות וספציפיות לאבחון BTHS21. שיטה מאומתת נוספת המבוססת על ניתוח HPLC ו-ESI/MS הוקמה על לויקוציטים22, אך הטכניקות הכרומטוגרפיות המורכבות להפרדת שומנים שחולצו בעבר ויקרות המכשירים מגבילות ניתוח זה למספר מעבדות קליניות. כל הגורמים הללו, יחד עם היעדר בדיקה אבחנתית פשוטה, תרמו לתת-אבחון של המצב.
MALDI-TOF/MS הוא כלי תקף נוסף בניתוח שומנים23,24. טכניקה אנליטית זו יכולה לשמש כדי לקבל ישירות פרופילי שומנים של דגימות ביולוגיות שונות, ובכך לדלג על שלבי מיצוי והפרדה 25,26,27,28,29, כולל בקטעי רקמות עבור יישומי הדמיה של MS30. בהינתן יתרון זה, פותחה שיטה פשוטהומהירה לאבחון BTHS על ידי יצירת פרופיל CL מיטוכונדריאלי בלוקוציטים שלמים עם MALDI-TOF/MS. בידוד לויקוציטים רק מ 1 מ”ל של דם שלם על ידי שקיעה אריתרוציטים ותזה הוא פשוט ואינו דורש ציוד מיוחד או ריאגנטים. יתר על כן, פרוטוקול “מיני-מיצוי” של שומנים מהירים החל על כמויות זעירות של לויקוציטים תואר כמצדיק רכישה מוצלחת של ספקטרה בעלת אותות טרשת נפוצה נקיים יותר עם יחס אות לרעש גבוה יותר (S/N) מאשר באלה המתקבלים מלוקוציטים שלמים28. צעד נוסף זה לוקח מעט זמן ומאפשר לשחזר ניתוחים גם כאשר הם מבוצעים במכשירי טרשת נפוצה עם רגישות ירודה. לסיכום, השיטה האנליטית המתוארת כאן דורשת הכנת דגימה מינימלית מכיוון שניתן לדלג על הפרדת שומנים כרומטוגרפית גוזלת זמן ועבודה אינטנסיבית, ובכך להאיץ את הבדיקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תסמונת בארת היא טעות מולדת של חילוף חומרים ומצב משנה חיים שסביר להניח שיהיה מאובחןבתת-אבחנה של 2,6. כאמור, גורם תורם עשוי להיות היעדר בדיקת אבחון פשוטה. כאן תוארה שיטה פשוטה ומהירה למדידת יחס MLCL/CL על ידי MALDI-TOF/MS בלוקוציטים לצורך בדיקת BTHS. יתר על כן, ספקטרומטר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאנשים עם BTHS ולמשפחותיהם על השתתפותם במחקר שלנו. אנו מודים לקרן תסמונת בארת בארה”ב ולקרן תסמונת בארת בריטניה על תמיכתם ועל הסיוע באיסוף דגימות הדם בפגישה השנתית בבריסטול. מחקר זה מומן על ידי קרן תסמונת בארת ארה”ב, בארת איטליה אונלוס ואזור אפוליה.
Materials
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
References
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al. syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract]. Archives of Disease in Childhood. 89, 48 (2004).
- Clarke, S. L. N., et al. Barth syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23 (2013).
- Zegallai, H. M., Hatch, G. M. Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).
- Taylor, C., et al. Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).
- Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population. The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).
- Bione, S., et al. A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome. Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).
- Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. Seven functional classes of Barth Syndrome mutation. Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).
- Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins. Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).
- Schlame, M., Xu, Y. The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase. Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).
- Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. The biosynthesis and functional role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).
- Mileykovskaya, E., Dowhan, W. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).
- Claypool, S. M., Koehler, C. M. The complexity of cardiolipin in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).
- Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin. Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects. Cells. 8 (7), 728 (2019).
- Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go. The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131 (2020).
- Schlame, M., et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).
- Wortmann, S. B., et al. Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).
- Ikon, N., Ryan, R. O. On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).
- Kulik, W., et al. Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome. Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).
- Vaz, F. M., et al. An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).
- Bowron, A., et al. Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).
- Sun, G., et al. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions. Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).
- Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids. Biomolecules. 8 (4), 173 (2018).
- Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine. The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).
- Angelini, R., et al. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS. The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).
- Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation. Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).
- Angelini, R., et al. Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome. The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).
- Lobasso, S., et al. A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential. Frontiers in Physiology. 12, 748895 (2021).
- Angelini, R., et al. Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).
- Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).
- Duncan, M., DeMarco, M. L. MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine. Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).
