Geração de Transgênicos e Nocautes em Espécies Strongyloides por Microinjeção

Strongyloides stercoralis tem sido negligenciado por muito tempo como um importante patógeno humano comparado com as minhocas mais reconhecidas e a lombriga Ascaris lumbricoides¹. Estudos anteriores de carga de vermes muitas vezes subestimaram severamente a prevalência de S. stercoralis devido à baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos comuns para S. stercoralis². Nos últimos anos, estudos epidemiológicos baseados em ferramentas de diagnóstico aprimoradas estimaram que a verdadeira prevalência de infecções por S. stercoralis é muito maior do que o relatado anteriormente, aproximadamente 610 milhões de pessoas em todo o mundo².

Tanto S. stercoralis quanto outras espécies strongyloides, incluindo o parasita de rato intimamente relacionado e o modelo de laboratório comum S. ratti, têm um ciclo de vida incomum que é vantajoso para estudos genômicos experimentais porque consiste tanto das gerações parasitárias quanto de vida livre (ambiental)³ (Figura 1). Especificamente, tanto S. stercoralis quanto S. ratti podem percorrer uma única geração de vida livre. A geração de vida livre consiste em larvas pós-parasitárias que se desenvolvem em machos e fêmeas adultos vivos livres; toda a descendência dos adultos livres se desenvolve em larvas infecciosas, que devem infectar um hospedeiro para continuar o ciclo de vida. Além disso, essa geração ambiental ou de vida livre pode ser manipulada experimentalmente em laboratório. Como adultos strongyloides de vida livre e adultos C. elegans compartilham morfologia semelhante, técnicas como microinjeção intragonadal que foram originalmente desenvolvidas para C. elegans podem ser adaptadas para uso com strongyloides^adultos de vida livre ^4,5. Enquanto o DNA é geralmente introduzido em fêmeas adultas de vida livre, tanto machos quanto fêmeas de Strongyloides podem ser microinjetados⁶. Assim, ferramentas genômicas funcionais estão disponíveis para interrogar muitos aspectos da biologia de Strongyloides. Outros nematoides parasitas não possuem uma geração livre e, como resultado, não são tão facilmente favoráveis às técnicas genômicas funcionais³.

Figura 1: O ciclo de vida Strongyloides stercoralis. As fêmeas parasitárias S. stercoralis habitam o intestino delgado de seus hospedeiros mamíferos (humanos, primatas não humanos, cães). As fêmeas parasitas se reproduzem por partenogênese e colocam ovos dentro do intestino delgado. Os ovos eclodem enquanto ainda estão dentro do hospedeiro em larvas pós-parasitárias, que são então passadas para o ambiente com fezes. Se as larvas pós-parasitárias são machos, elas se desenvolvem em machos adultos vivos livres. Se as larvas pós-parasitárias forem fêmeas, elas podem se desenvolver em fêmeas adultas de vida livre (desenvolvimento indireto) ou larvas infecciosas de terceiro estágio (iL3s; desenvolvimento direto). Os machos e fêmeas que vivem livremente se reproduzem sexualmente para criar descendentes que são constrangidos a se tornarem iL3s. Sob certas condições, S. stercoralis também pode sofrer autoinfecção, na qual algumas das larvas pós-parasitárias permanecem dentro do intestino hospedeiro em vez de passar para o ambiente em fezes. Essas larvas podem evoluir para larvas autoinfetivas (L3a) dentro do hospedeiro, penetrar através da parede intestinal, migrar através do corpo e, eventualmente, retornar ao intestino para se tornarem adultos reprodutivos. O ciclo de vida de S. ratti é semelhante, exceto que S. ratti infecta ratos e não tem um ciclo autoinfetivo. A geração ambiental é fundamental para o uso de espécies Strongyloides para estudos genéticos. As fêmeas adultas de vida livre (P₀) podem ser microinjetadas; sua descendência, que todos se tornarão iL3s, são os transgênicos F₁ potenciais. Este valor foi modificado de Castelletto et al. ³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

S. stercoralis compartilha muitos aspectos de sua biologia com outros nematoides gastrointestinais humanos-parasitas, incluindo invasão de hospedeiro e modulação imunológica hospedeira. Por exemplo, as minhocas parasitárias humanas nos gêneros Necator e Ancylostoma também infectam pela penetração da pele, navegam de forma semelhante através do corpo e, em última análise, residem como adultos parasitas no intestino delgado⁷. Assim, muitos nematoides gastrointestinais provavelmente usam comportamentos sensoriais comuns e técnicas de evasão imunológica. Como resultado, o conhecimento obtido de Strongyloides complementará os achados em outros nematoides menos geneticamente tratáveis e levará a uma compreensão mais completa desses parasitas complexos e importantes.

Este protocolo de microinjeção descreve o método para introduzir DNA em fêmeas adultas de vida livre strongyloides para fazer prole transgênico e mutante. Os requisitos de manutenção da cepa, incluindo o tempo de desenvolvimento de vermes adultos para microinjeções e a coleta de progêneria transgênica, são descritos. Protocolos e uma demonstração da técnica completa de microinjeção, juntamente com protocolos para cultivo e triagem de progêneria transgênica, estão incluídos, juntamente com uma lista de todos os equipamentos e consumíveis necessários.