Генерация трансгенов и нокаутов у видов стронгилоидов путем микроинъекции
Summary
Функциональный геномный инструментарий для паразитических нематод Strongyloides stercoralis и Strongyloides ratti включает трансгенез, CRISPR/Cas9-опосредованный мутагенез и RNAi. Этот протокол продемонстрирует, как использовать внутригонадную микроинъекцию для введения трансгенов и компонентов CRISPR в S. stercoralis и S. ratti.
Abstract
Род Strongyloides состоит из нескольких видов проникающих в кожу нематод с различными диапазонами хозяев, включая Strongyloides stercoralis и Strongyloides ratti. S. stercoralis является паразитической, проникающей в кожу нематодой, которая заражает около 610 миллионов человек, в то время как крысиный паразит S. ratti тесно связан с S. stercoralis и часто используется в качестве лабораторной модели для S. stercoralis. И S. stercoralis , и S. ratti легко поддаются генерации трансгенов и нокаутов с помощью метода доставки экзогенных нуклеиновых кислот интрагонадной микроинъекции и, как таковые, появились в качестве модельных систем для других паразитических гельминтов, которые еще не поддаются этому методу.
Паразитические strongyloides взрослые населяют тонкую кишку своего хозяина и выпускают потомство в окружающую среду через фекалии. Попав в окружающую среду, личинки развиваются в свободноживущих взрослых особей, которые живут в фекалиях и производят потомство, которое должно найти и вторгнуться в нового хозяина. Это поколение окружающей среды уникально для видов Strongyloides и достаточно похоже по морфологии на модель свободноживущей нематоды Caenorhabditis elegans , что методы, разработанные для C. elegans , могут быть адаптированы для использования с этими паразитическими нематодами, включая внутригонадную микроинъекцию. Используя внутригонадную микроинъекцию, в стронгилоиды можно вводить широкий спектр трансгенов. Компоненты CRISPR/Cas9 также могут быть микроинъектированы для создания мутантных личинок Strongyloides . Здесь описана методика интрагонадной микроинъекции в стронгилоиды, включая подготовку свободноживущих взрослых, процедуру инъекций и отбор трансгенного потомства. Включены изображения трансгенных личинок Strongyloides , созданных с использованием мутагенеза CRISPR/Cas9. Цель этой статьи состоит в том, чтобы позволить другим исследователям использовать микроинъекцию для создания трансгенных и мутантных стронгилоидов.
Introduction
Strongyloides stercoralis долгое время игнорировался как важный патоген человека по сравнению с более широко признанными анкилостомами и круглым червем Ascaris lumbricoides1. Предыдущие исследования глистной нагрузки часто сильно недооценивали распространенность S. stercoralis из-за низкой чувствительности общих методов диагностики S. stercoralis2. В последние годы эпидемиологические исследования, основанные на улучшенных диагностических инструментах, показали, что истинная распространенность инфекций S. stercoralis намного выше, чем сообщалось ранее, примерно 610 миллионов человек во всем мире2.
Как S. stercoralis, так и другие виды Strongyloides, включая близкородственного крысиного паразита и общую лабораторную модель S. ratti, имеют необычный жизненный цикл, который выгоден для экспериментальных геномных исследований, поскольку он состоит как из паразитических, так и из свободноживущих (экологических) поколений3 (рисунок 1). В частности, как S. stercoralis, так и S. ratti могут циклически проходить через одно свободноживущее поколение. Свободноживущее поколение состоит из постпаразитарных личинок, которые развиваются в свободноживущих взрослых самцов и самок; все потомство свободноживущих взрослых особей развивается в инфекционных личинок, которые должны заразить хозяина, чтобы продолжить жизненный цикл. Кроме того, этим экологическим или свободноживущим поколением можно экспериментально манипулировать в лаборатории. Поскольку свободноживущие взрослые strongyloides и взрослые особи C. elegans имеют схожую морфологию, такие методы, как интрагонадная микроинъекция, которые были первоначально разработаны для C. elegans, могут быть адаптированы для использования со свободноживущими взрослыми Strongyloides 4,5. В то время как ДНК обычно вводится в свободно живущих взрослых самок, как самцы, так и самки стронгилоидов могут быть микроинъективированы6. Таким образом, функциональные геномные инструменты доступны для изучения многих аспектов биологии стронгилоидов. Другие паразитические нематоды не имеют свободно живущего поколения и, как следствие, не так легко поддаются функциональным геномным методам3.
Рисунок 1: Жизненный цикл Strongyloides stercoralis. Паразитические самки S. stercoralis населяют тонкую кишку своих млекопитающих-хозяев (людей, нечеловеческих приматов, собак). Паразитические самки размножаются путем партеногенеза и откладывают яйца в тонком кишечнике. Яйца вылупляются, все еще находясь внутри хозяина, в постпаразитарные личинки, которые затем попадают в окружающую среду с фекалиями. Если постпаразитарные личинки являются самцами, они развиваются в свободноживущих взрослых самцов. Если постпаразитарные личинки являются самками, они могут либо развиться в свободноживущих взрослых самок (косвенное развитие), либо в личинок третьей стадии инфекции (iL3s; прямое развитие). Свободно живущие самцы и самки размножаются половым путем, чтобы создать потомство, которое ограничено, чтобы стать iL3s. При определенных условиях S. stercoralis также может подвергаться аутоинфекции, при которой часть постпаразитарных личинок остается внутри кишечника хозяина, а не попадает в окружающую среду с калом. Эти личинки могут развиваться в аутоинфективные личинки (L3a) внутри хозяина, проникать через стенку кишечника, мигрировать по организму и в конечном итоге возвращаться в кишечник, чтобы стать репродуктивными взрослыми. Жизненный цикл S. ratti аналогичен, за исключением того, что S. ratti заражает крыс и не имеет аутоинфекционного цикла. Генерация окружающей среды является ключом к использованию видов Strongyloides для генетических исследований. Свободно живущие взрослые самки (P0) могут быть микроинъективированы; их потомство, которое станет iL3s, является потенциальным трансгеномF1. Эта цифра была изменена по сравнению с Castelletto et al. 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
S. stercoralis разделяет многие аспекты своей биологии с другими желудочно-кишечными паразитическими нематодами, включая инвазию хозяина и иммунную модуляцию хозяина. Например, человеко-паразитические анкилостомы в родах Necator и Ancylostoma также заражаются при проникновении в кожу, аналогичным образом перемещаются по телу и в конечном итоге живут как паразитические взрослые в тонком кишечнике7. Таким образом, многие желудочно-кишечные нематоды, вероятно, используют общее сенсорное поведение и методы уклонения от иммунитета. В результате знания, полученные от Strongyloides , дополнят результаты у других менее генетически поддающихся лечению нематод и приведут к более полному пониманию этих сложных и важных паразитов.
Этот протокол микроинъекции описывает метод введения ДНК в Strongyloides свободноживущих взрослых самок для создания трансгенного и мутантного потомства. Описаны требования к поддержанию штамма, включая сроки развития взрослых червей для микроинъекций и сбор трансгенного потомства. Протоколы и демонстрация полной техники микроинъекции, наряду с протоколами культивирования и скрининга трансгенного потомства, включены вместе со списком всего необходимого оборудования и расходных материалов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол микроинъекции подробно описывает методы введения конструкций для трансгенеза и CRISPR/Cas9-опосредованного мутагенеза в S. stercoralis и S. ratti. Как для S. stercoralis , так и для S. ratti выживаемость после инъекции и скорость трансгенеза или мутагенеза зависят от нескольки…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pPV540 и pPV402 были добрыми подарками от доктора Джеймса Лока из Университета Пенсильвании. Мы благодарим Астру Брайант за полезные комментарии к рукописи. Эта работа финансировалась премией Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, премией Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award и National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
Materials
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
- Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
- Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, 206482 (2020).
- Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , (2013).
- Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
- Schafer, T. W., Skopic, A. Parasites of the small intestine. Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
- Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
- Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3′ UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
- Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
- Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
- Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
- Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
- Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
- Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
- Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
- Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5′-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. 유전학. 216 (4), 947-956 (2020).
- Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
- Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
- Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
- Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
- Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. 유전학. 199 (4), 959-971 (2015).
- Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
- Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
- Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
- Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
- Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
- Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
- Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).
