Summary

マイクロインジェクションによる ストロンギロイデス 種におけるトランスジェニックとノックアウトの生成

Published: October 07, 2021
doi:

Summary

寄生性線虫 Strongyloides stercoralis および Strongyloides ratti のための機能的ゲノムツールキットには、トランスジェネシス、CRISPR/Cas9媒介突然変異誘発、およびRNAiが含まれる。このプロトコルは、生殖腺内マイクロインジェクションを使用して、導入遺伝子およびCRISPR成分を S. stercoralis および S. rattiに導入する方法を実証する。

Abstract

ストロンギロイデス属は、ストロンギロイデス・ステロイドおよびストロンギロイデス・ラティを含む、異なる宿主範囲を有する皮膚貫通線虫の複数種からなる。S. stercoralisは、約6億1000万人に感染するヒト寄生性の皮膚透過性線虫であり、ラット寄生虫S. rattiはS. stercoralisと密接に関連しており、S. stercoralisの実験室モデルとしてしばしば使用されている。 S. stercoralisS. rattiの両方は、生殖腺内マイクロインジェクションの外因性核酸送達技術によるトランスジェニックおよびノックアウトの生成に容易に順応性であり、したがって、この技術にまだ順応していない他の寄生性蠕虫のモデルシステムとして浮上している。

寄生性 ストロンギロイデス 成虫は宿主の小腸に生息し、糞便を介して子孫を環境に放出する。環境に入ると、幼虫は糞便に住み、新しい宿主を見つけて侵入しなければならない子孫を産む自由生活の成虫に発達する。この環境生成は ストロンギロイデス 種に特有のものであり、モデルの自由生活線虫 Caenorhabditis elegansに形態が十分に類似しており、 C. elegans のために開発された技術は、性腺内マイクロインジェクションを含むこれらの寄生性線虫での使用に適合させることができる。生殖腺内マイクロインジェクションを用いて、多種多様な導入遺伝子を ストロンギロイデスに導入することができる。CRISPR/Cas9成分をマイクロインジェクションして、変異型 ストロンギロイデス 幼虫を作成することもできる。ここでは、自由生存成人の調製、注射手順、およびトランスジェニック子孫の選択を含む、 ストロンギロイデス への性腺内マイクロインジェクションの技術について説明する。CRISPR/Cas9突然変異誘発を用いて作製されたトランスジェニックスト ロンギロイデス 幼虫の画像が含まれる。この論文の目的は、他の研究者がマイクロインジェクションを使用してトランスジェニックおよび変異型の ストロンギロイデスを作成できるようにすることです。

Introduction

ストロンギロイデス・ステコラリスは、より広く認識されている鉤虫や回虫のアスカリス・ルンブリコイデス1と比較して、重要なヒト病原体として長い間見過ごされてきたワームの負担に関する以前の研究では、S.スターコラリス2の一般的な診断方法の感度が低いため、S.スターコラリスの有病率をしばしばひどく過小評価していました。近年、改良された診断ツールに基づく疫学的研究は、S.ステルコラリス感染症の真の有病率は、以前に報告されたよりもはるかに高く、世界中で約6億1000万人と推定されている2

S. stercoralisと他のストロンギロイデス種(近縁のラット寄生虫および共通ラボモデルS. rattiを含む)は、寄生世代と自由生活(環境)世代の両方からなるため、実験的ゲノム研究に有利な異常なライフサイクルを持っています3(図1)。具体的には、S. stercoralisS. rattiの両方が単一の自由生活世代を循環させることができます。自由生活世代は、自由生活の成人男性と女性に発達する寄生後の幼虫からなる。自由生活の成虫のすべての子孫は感染性の幼虫に発達し、ライフサイクルを継続するために宿主に感染しなければならない。さらに、この環境世代または自由生活世代は、実験室で実験的に操作することができる。自由生活のストロンギロイデス成虫とC.エレガンス成虫は類似の形態を共有しているため、もともとC.エレガンスのために開発された性腺内マイクロインジェクションなどの技術は、自由生活の成体ストロンギロイデス4,5での使用に適合させることができる。DNAは一般に自由生活の成人女性に導入されるが、ストロンギロイデスの男性と女性の両方にマイクロインジェクションすることができる6。したがって、機能的ゲノムツールは、ストロンギロイデスの生物学の多くの側面を調査するために利用可能である。他の寄生性線虫は自由生活世代を欠いており、その結果、機能的ゲノム技術に容易に順応していない3

Figure 1
図1:ストロンギロイデス・ステロイドのライフサイクル S.ステルコラリス寄生雌は、哺乳類宿主(ヒト、非ヒト霊長類、イヌ)の小腸に生息する。寄生雌は単為生殖によって繁殖し、小腸内で卵を産む。卵は宿主の内部に留まっている間に孵化し、寄生後幼虫に孵化し、糞便とともに環境に渡される。寄生後の幼虫が雄である場合、それらは自由生活の成人男性に発達する。寄生後幼虫が雌である場合、それらは自由生活の成体雌(間接発達)または第3段階の感染性幼虫(iL3s;直接発達)のいずれかに発達することができる。自由生活の男性と女性は、iL3になるように制約されている子孫を作り出すために性的に繁殖します。特定の条件下では、S. stercoralisはまた、寄生後幼虫の一部が糞便中の環境に入るのではなく宿主腸内に留まる自己感染を受ける可能性がある。これらの幼虫は、宿主内で自己感染性幼虫(L3a)に発達し、腸壁を貫通し、体内を移動し、最終的に腸に戻って生殖成虫になることができる。S. rattiの生活環は、S. rattiがラットに感染し、自己感染サイクルを持たないことを除いて、類似している。環境生成は、遺伝学的研究にストロンギロイデス種を使用するための鍵です。自由生活の成人女性(P0)にはマイクロインジェクションすることができます。それらの子孫は、すべてiL3sになり、潜在的なF1遺伝子導入薬である。この図はカステルレットらから修正されたものである。3. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

S. stercoralisは 、宿主の侵入や宿主の免疫調節を含む他の胃腸ヒト寄生性線虫と生物学の多くの側面を共有しています。例えば、 Necator 属および Ancylostoma 属のヒト寄生性鉤虫も皮膚浸透によって感染し、同様に体内をナビゲートし、そして最終的には小腸に寄生成体として存在する7。したがって、多くの胃腸線虫は、一般的な感覚行動および免疫回避技術を使用する可能性が高い。その結果、 ストロンギロイデス から集められた知識は、他の遺伝的に扱いにくい線虫の発見を補完し、これらの複雑で重要な寄生虫のより完全な理解につながるでしょう。

このマイクロインジェクションプロトコルは、トランスジェニックおよび突然変異体の子孫を作るために 、ストロンギロイデス の自由生活の成人女性にDNAを導入する方法を概説しています。マイクロインジェクションのための成虫の発生時期およびトランスジェニック子孫の収集を含む、株維持要件が記載されている。プロトコルと完全なマイクロインジェクション技術のデモンストレーション、トランスジェニック子孫の培養とスクリーニングのためのプロトコルが、必要なすべての機器と消耗品のリストとともに含まれています。

Protocol

注:スナネズミはS. ステルコラリスの継代に使用され、ラットは S.ラッティの継代に使用された。すべての手順は、AAALAC規格および実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠しているUCLA動物研究監督局(議定書番号2011-060-21A)によって承認されました。以下のタスクは、マイクロインジェクションの少なくとも1日前に完了しなければならない:ワームの培養、マイクロインジェク?…

Representative Results

実験が成功した場合、F1幼虫は目的の導入遺伝子および/または変異表現型を発現する(図4)。しかし、形質転換率は非常に変動し、構築物、ワームの健康状態、注射後の培養条件、および実験者のスキルに依存する。一般に、実験が成功すると、注射された雌あたり>15F1幼虫が得られ、蛍光マーカーの形質転換率は>3%となる。生きている子孫の総数が平均?…

Discussion

このマイクロインジェクションプロトコルは、トランスジェネシスおよびCRISPR/Cas9媒介突然変異誘発のための構築物を S. stercoralis および S. ratti に導入するための方法を詳述する。S. stercoralisS. rattiの両方について、注射後の生存率およびトランスジェネシスまたは突然変異誘発の速度は、微調整可能ないくつかの変数の影響を受けます。

ト?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

pPV540とpPV402は、ペンシルベニア大学のジェームズ・ロック博士からの親切な贈り物でした。原稿に関する有益なコメントをくれたAstra Bryantに感謝します。この研究は、バローズ・ウェルカム基金の研究者から、疾患の病因賞、ハワード・ヒューズ医学研究所教員奨学生賞、国立衛生研究所R01 DC017959(E.A.H.)から資金提供を受けました。

Materials

(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid Sigma-Aldrich N3876-5ML nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) VWR 470121-790 C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE Phenix RBA-500 agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh Ebonex n/a charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh Reade bonechar10x28 charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator Narishige MMN-1 coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters Fisher 07-200-385 microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness Brain Research Lab 4860-1 coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter VWR 82050-918 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod Fisher 12-000-101 stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips VWR 89009-310 for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads Fisher 14-206-62 bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings Fisher 14-050CQ Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers Fisher 14-955-111F Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe McMaster-Carr 7541A51 glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898-50ML halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD McMaster-Carr 3038K24 tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase VWR 89001-414 Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors Fisher 15-235-101 bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence Leica M165 FC GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder Tritech MINJ-4 microinjection needle holder
microINJECTOR system Tritech MINJ-1 microinjection system
Mongolian Gerbils Charles River Laboratories 213-Mongolian Gerbil gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz VWR 11216-776 Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh) Jo-Ann Fabrics zprd_14061949a nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch Thomas Scientific 1233S72 platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) VWR 62505-007 wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106 QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans Envigo 140 HsdBlu:LE Long Evans rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley Envigo 002 Hsd:Sprague Dawley SD rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" Office Depot 452369 plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches Newco 999589 techboard
Stainless steel raised wire floor Ancare R20SSRWF wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 Office Depot 9587303 spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm Carolina (Science) 741012 watch glasses (small, round)
Stereomicroscope Motic K-400 LED dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite Grainger 53GN16 plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller Sutter P-30/P needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses Fisher S34826 watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps Fisher 05-769-2Q funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator Narishige MM0-4 fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps Fisher S99422 Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) Tritech Research T3308P 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers VWR 82003-820 lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in Carolina (Science) 742300 watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter Fisher 09-805B filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter Fisher 09-805D filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in Fisher 50-821-813 glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade Office Depot 238816 X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1 Zeiss n/a inverted microscope

References

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Castelletto, M. L., Hallem, E. A. Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection. J. Vis. Exp. (176), e63023, doi:10.3791/63023 (2021).

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