Her etablerer vi en protokol til samtidig at visualisere og analysere flere SMAD-komplekser ved hjælp af nærhed ligation assay (PLA) i endotelceller udsat for patologiske og fysiologiske væskeforskydningsstress betingelser.
Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering er stramt reguleret og afbalanceret under udvikling og homøostase i vaskulatsystemet Derfor resulterer deregulering i denne signalvej i alvorlige vaskulære patologier, såsom lungepulsåren hypertension, arvelig hæmoragisk telangiectasia og åreforkalkning. Endotelceller (ECs), som det inderste lag af blodkar, er konstant udsat for væskeforskydning stress (SS). Unormale mønstre af væske SS har vist sig at forbedre TGFβ/BMP signalering, som sammen med andre stimuli fremkalder åreogenese. I forbindelse med dette, atheroprone, lav laminar SS blev fundet at forbedre TGFβ / BMP signalering mens atheroprotective, høj laminar SS, mindsker denne signalering. For effektivt at analysere aktiveringen af disse veje designede vi en arbejdsgang for at undersøge dannelsen af transskriptionsfaktorkomplekser under lav laminar SS og høje laminar SS-forhold ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt pneumatisk pumpesystem og nærhed ligation assay (PLA).
Aktiv TGFβ/BMP-signalering kræver dannelse af trimeriske SMAD-komplekser bestående af to regulatoriske SMAD’er (R-SMAD); SMAD2/3 og SMAD1/5/8 for henholdsvis TGFβ- og BMP-signalering) med en fælles mægler SMAD (co-SMAD; SMAD4). Ved hjælp af PLA rettet mod forskellige underenheder af trimerisk SMAD-kompleks, dvs. enten R-SMAD/co-SMAD eller R-SMAD/R-SMAD, kan dannelsen af aktive SMAD transskriptionsfaktorkomplekser måles kvantitativt og rumligt ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
Brugen af flow slides med 6 små parallelle kanaler, der kan tilsluttes i serier, giver mulighed for undersøgelse af transskription faktor kompleks dannelse og inddragelse af nødvendige kontroller.
Arbejdsgangen forklaret her kan let tilpasses til undersøgelser rettet mod nærheden af SMADs til andre transskription faktorer eller til transskription faktor komplekser andre end SMADs, i forskellige flydende SS betingelser. Den arbejdsgang, der præsenteres her, viser en hurtig og effektiv måde at studere den flydende SS inducerede TGFβ/BMP-signalering i ECs, både kvantitativt og rumligt.
Proteiner af de transformerende vækstfaktorer beta (TGFβ) superfamily er pleiotropiske cytokiner med en række medlemmer, herunder TGFβs, knoglemorfogenetiske proteiner (BMB’er) og Activins1,2. Ligandbinding fremkalder dannelsen af receptor oligomerer, der fører til fosforylering og dermed aktivering af cytosolic reguleringsmæssig SMAD (R-SMAD). Afhængigt af ligandernes underfamilie aktiveres forskellige R-SMAD’er1,2. Mens TGFβs og Activins hovedsagelig fremkalder fosforylering af SMAD2/3, fremkalder BMB’er SMAD1/5/8 fosforylering. Der er imidlertid akkumulerende beviser for, at BMPs og TGFβs/Activins også aktiverer R-SMAD’er for den respektive anden underfamilie i en proces, der betegnes som »lateral signalering«3,4,5,6,7,8, og at der er blandede SMAD-komplekser bestående af både SMAD1/5 og SMAD2/3, medlemmer3,9 . To aktiverede R-SMAD’er danner efterfølgende trimeriske komplekser med den fælles mægler SMAD4. Disse transskription faktor komplekser er derefter i stand til at translokere ind i kernen og regulere transskription af mål gener. SMAD’er kan interagere med en række forskellige transskriptionskoaktiveringatorer og co-repressorer, hvilket fører til diversificering af mulighederne for at regulere målgener10. Deregulering af SMAD-signalering har alvorlige konsekvenser for en række sygdomme. I overensstemmelse med dette, ubalanceret TGFβ/BMP signalering kan føre til alvorlige vaskulære patologier, såsom lungepulsåren hypertension, arvelig hæmoragisk telangiectasia, eller åreforkalkning3,11,12,13,14.
Endotelceller (ECs) danner det inderste lag af blodkar og udsættes derfor for forskydningsstress (SS), en friktionskraft udøvet af blodets tyktflydende strøm. Interessant nok holdes ECs, der er bosiddende på de dele af vaskulaturen, som udsættes for høje niveauer af ensartet, laminar SS, i en homøostatisk og quiescent tilstand. I modsætning hertil er ECs, der oplever lav, ikke-ensartet SS, f.eks. ved bifurcations eller den mindre krumning af aortabuen, proliferative og aktiverer inflammatoriske veje15. Til gengæld er steder med dysfunktionelle ECs tilbøjelige til at udvikle åreforkalkning. Interessant nok viser ECs i disse atheroprone områder afvigende høje niveauer af aktiveret SMAD2/3 og SMAD1/516,17,18. I denne sammenhæng viste det sig, at forbedret TGFβ/BMP-signalering var en tidlig hændelse i udviklingen af aterosklerotiske læsioner19, og interferens med BMP-signalering viste sig at reducere vaskulær betændelse, ateromadannelse og tilhørende forkalkning20.
Proximity Ligation Assay (PLA) er en biokemisk teknik til at studere protein-protein interaktioner in situ21,22. Det er afhængig af specificiteten af antistoffer af forskellige arter, der kan binde målproteiner af interesse, hvilket giver mulighed for meget specifik påvisning af endogene proteininteraktioner på et enkeltcellet niveau. Her skal primære antistoffer binde sig til deres mål epitope i en afstand af mindre end 40 nm for at give mulighed for detektion23. Derfor er PLA i høj grad gavnlig i forhold til traditionelle co-immunprecipitation tilgange, hvor flere millioner celler er nødvendige for at opdage endogene protein interaktioner. I PLA binder artsspecifikke sekundære antistoffer, der er kovalent forbundet med DNA-fragmenter (såkaldte Plus- og Minus-sonder), de primære antistoffer, og hvis interesseproteinerne interagerer, kommer Plus- og Minus-sonder tæt på. DNA’et bliver ligated i det følgende trin, og den rullende cirkelforstærkning af det cirkulære DNA er muliggjort. Under forstærkning binder fluorescerende mærkede komplementære oligoukleotider sig til det syntetiserede DNA, hvilket gør det muligt at visualisere disse proteininteraktioner ved konventionel fluorescensmikroskopi.
Den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt for forskere kvantitativt at sammenligne antallet af aktive SMAD transskriptionskomplekser ved atheroprotive og atheroprone SS-tilstande in vitro ved hjælp af PLA. SS genereres via et programmerbart pneumatisk pumpesystem, der er i stand til at generere laminar ensrettet strøm af definerede niveauer og tillader trinvise stigninger i flowhastigheder. Denne metode gør det muligt at påektionere interaktioner mellem SMAD1/5 eller SMAD2/3 med SMAD4 samt blandede R-SMAD-komplekser. Det kan nemt udvides til at analysere interaktioner af SMADs med transskriptionelle medregulatorer eller til transskriptionsfaktorkomplekser bortset fra SMAD’er. Figur 1 viser de vigtigste trin i protokollen nedenfor.
Figur 1: Skematisk repræsentation af den beskrevne protokol. (A) Celler, der er sået i 6-kanals dias, udsættes for forskydningsstress med et pneumatisk pumpesystem. (B) Faste celler anvendes til PLA-eksperiment eller til kontrolbetingelser. (C) Billeder af PLA eksperimenter er erhvervet med en fluorescens mikroskop og analyseres ved hjælp af ImageJ analyse software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den PLA-baserede protokol, der er beskrevet her, tilbyder en effektiv måde at bestemme nærheden af to proteiner (f.eks. deres direkte interaktion) i ECs udsat for forskydningsstress med kvantitativ og rumlig opløsning. Ved at bruge flow slides med flere parallelle kanaler, flere forskellige protein interaktioner kan undersøges på samme tid i celler under identiske mekaniske forhold. I modsætning hertil gør specialbyggede flowkammersystemer ofte brug af en enkelt kanal, der er bygget op omkring en glasdækslede, hv…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Maria Reichenbach og Dr. Christian Hiepen for deres støtte på flow-oprettet system og Eleanor Fox og Yunyun Xiao for kritisk at læse manuskriptet. P-L.M. blev finansieret af den internationale Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK modtog støtte fra DFG-SFB1444. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af BioRender.
µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
FIJI | Image Analysis software | ||
Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
HUVECs | |||
ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |