使用接近-连接-测定法对不同流体剪切应力条件下TGFβ/BMP/SMAD信号传导的可视化和定量

转化生长因子β（TGFβ）超家族的蛋白质是多效性细胞因子，具有多种成员，包括TGFβ，骨形态发生蛋白（BMP）和Activins1^，2。配体结合诱导受体低聚物的形成，导致磷酸化，从而激活细胞质调节性SMAD（R-SMAD）。根据配体的亚家族，激活不同的R-SMAD1^，2。虽然TGFβs和激活素主要诱导SMAD2 / 3的磷酸化，但BMP诱导SMAD1 / 5 / 8磷酸化。然而，越来越多的证据表明，BMPs和TGFβs/Activins也激活了各自其他亚家族的R-SMAD，其过程称为”横向信号传导”^3，4，^{5，6，7，8}，并且存在由SMAD1 / 5和SMAD2 / 3组成的混合SMAD复合物，成员^3，9.两个活化的R-SMAD随后与共同介质SMAD4形成三聚体复合物。然后，这些转录因子复合物能够易位到细胞核中并调节靶基因的转录。SMAD可以与各种不同的转录共激活剂和共抑制剂相互作用，从而导致调节靶基因的可能性多样化¹⁰。SMAD信号传导的放松管制对多种疾病都有严重影响。与此一致，不平衡的 TGFβ/BMP 信号传导可能导致严重的血管病变，例如肺动脉高压、遗传性出血性毛细血管扩张症或动脉粥样硬化^{3，11，12，13，14}。

内皮细胞（EC）形成血管的最内层，因此暴露于剪切应力（SS），这是由血液粘性流动施加的摩擦力。有趣的是，居住在脉管系统部分的EC暴露于高水平的均匀层流SS，保持稳态和静止状态。相反，经历低、不均匀 SS 的 EC（例如，在主动脉弓的分叉或较小曲率处）会增殖并激活炎症通路¹⁵。反过来，功能失调的EC的部位容易发生动脉粥样硬化。有趣的是，这些动脉粥样硬化区域中的EC显示出异常高水平的激活SMAD2 / 3和SMAD1 / ^{516，17，18}。在这种情况下，发现增强的TGFβ / BMP信号传导是动脉粥样硬化病变发展的早期事件¹⁹ ，并且发现对BMP信号传导的干扰可显着减少血管炎症，动脉粥样硬化形成和相关钙化²⁰。

邻近连接测定（PLA）是一种原位研究蛋白质 – 蛋白质相互作用的生化技术^21，22。它依赖于可以结合目标蛋白的不同物种抗体的特异性，从而允许在单细胞水平上高度特异性地检测内源性蛋白质相互作用。在这里，一抗必须在小于40nm的距离内与其靶表位结合，以允许检测²³。因此，PLA与传统的共免疫沉淀方法相比非常有益，因为传统共免疫沉淀方法需要数百万个细胞来检测内源性蛋白质相互作用。在PLA中，物种特异性二抗与DNA片段共价连接（称为加号和减号探针），与一抗结合，如果感兴趣的蛋白质相互作用，加号和减号探针非常接近。DNA在下一步中结扎，并且使环状DNA的滚动圆扩增成为可能。在扩增过程中，荧光标记的互补寡核苷酸与合成的DNA结合，允许通过常规荧光显微镜观察这些蛋白质相互作用。

这里描述的方案使科学家能够使用PLA定量比较体 外 动脉粥样硬化保护和阿瑟罗普酮SS条件下活性SMAD转录复合物的数量。SS通过可编程气动泵系统产生，该系统能够产生定义水平的层流单向流量，并允许逐步增加流速。该方法允许检测SMAD1 / 5或SMAD2 / 3与SMAD4之间的相互作用，以及混合R-SMAD复合物。它可以很容易地扩展到分析SMAD与转录共调节因子的相互作用或SMAD以外的转录因子复合物。 图 1 显示了下面显示的协议的主要步骤。

图1：所描述的协议的示意图。 （A）接种在6通道载玻片中的细胞暴露于气动泵系统的剪切应力。（B）固定电池用于PLA实验或用于对照条件。（C）使用荧光显微镜获取PLA实验的图像，并使用ImageJ分析软件进行分析。 请点击此处查看此图的放大版本。