التصور والتحديد الكمي للإشارات TGFβ/BMP/SMAD تحت ظروف إجهاد القص السائل المختلفة باستخدام القرب-الربط-المقايسة
Summary
هنا، نضع بروتوكولا لتصور وتحليل مجمعات SMAD المتعددة في وقت واحد باستخدام مقايسة ربط القرب (PLA) في الخلايا البطانية المعرضة لظروف إجهاد القص المرضي والفسيولوجي.
Abstract
تحويل عامل النمو β (TGFа) / العظام Morphogenetic البروتين (BMP) الإشارات هو تنظيم محكم ومتوازنة أثناء تطوير وتوازن الأوعية الدموية النظام وبالتالي، إلغاء الضوابط التنظيمية في هذا المسار الإشارات يؤدي إلى أمراض الأوعية الدموية الحادة، مثل ارتفاع ضغط الدم الشريان الرئوي، وtelangiectasia النزفية الوراثية، وتصلب الشرايين. تتعرض الخلايا البطانية (ECs)، باعتبارها الطبقة الأعمق من الأوعية الدموية، باستمرار لإجهاد القص السائل (SS). وقد ثبت أنماط غير طبيعية من السائل SS لتعزيز إشارات TGFβ / BMP، والتي، جنبا إلى جنب مع غيرها من المحفزات، والحث على تكوين الشرايين. وفيما يتعلق بهذا, atheroprone, تم العثور على انخفاض صفح SS لتعزيز TGFβ/ BMP الإشارات في حين atheroprotective, ارتفاع صفح SS, يقلل من هذه الإشارات. لتحليل كفاءة تفعيل هذه المسارات، قمنا بتصميم سير العمل للتحقيق في تشكيل مجمعات عامل النسخ تحت SS صفح منخفضة وظروف SS صفح عالية باستخدام نظام مضخة هوائية متاحة تجاريا وقربها اختبار الربط (جيش التحرير الشعبى الصينى).
يتطلب إشارات TGFβ/BMP النشطة تكوين مجمعات SMAD ثلاثية الأطراف تتكون من اثنين من الأنظمة SMAD (R-SMAD)؛ SMAD2/3 و SMAD1/5/8 للإشارات TGFβ وBMP، على التوالي) مع وسيط مشترك SMAD (شارك SMAD؛ SMAD4). باستخدام PLA استهداف وحدات فرعية مختلفة من مجمع SMAD ثلاثية، أي R-SMAD/co-SMAD أو R-SMAD/R-SMAD، يمكن قياس تشكيل مجمعات عامل النسخ SMAD النشطة كميا ومكانيا باستخدام المجهر الفلوري.
استخدام الشرائح تدفق مع 6 قنوات متوازية صغيرة، التي يمكن توصيلها في سلسلة، ويسمح للتحقيق في تشكيل عامل النسخ المعقدة وإدراج الضوابط اللازمة.
يمكن تكييف سير العمل الموضح هنا بسهولة للدراسات التي تستهدف قرب SMADs من عوامل النسخ الأخرى أو مجمعات عوامل النسخ بخلاف SMADs ، في ظروف SS السوائل المختلفة. يظهر سير العمل المعروض هنا طريقة سريعة وفعالة لدراسة إشارات TGFβ/BMP المستحثة SS السائلة في ECs ، كميا ومكانيا.
Introduction
بروتينات عوامل النمو التحويلية بيتا (TGFа) superfamily هي السيتوكينات ذات الجليوتروبيك مع مجموعة متنوعة من الأعضاء، بما في ذلك TGFβs، والبروتينات مورفوجينية العظام (BMPs)، وActivins1،2. ملزمة ليغاند يحفز تشكيل أوليغومرات مستقبلات مما يؤدي إلى الفوسفور، وبالتالي، تفعيل SMAD التنظيمية الخلوية (R-SMAD). اعتمادا على العائلة الفرعية من ligands، يتم تنشيط R-SMADs مختلفة1،2. في حين أن TGFβs وActivins تحفز أساسا الفوسفور من SMAD2/3، BMPs حث SMAD1/5/8 الفوسفور. ومع ذلك، هناك أدلة متراكمة على أن BMPs و TGFβs/Activins ينشطون أيضا R-SMADs من الأسرة الفرعية الأخرى المعنية، في عملية تسمى “الإشارات الجانبية” 3،4،5،6،7،8 وأن هناك مجمعات SMAD مختلطة تتكون من كليهما، SMAD1/5 و SMAD2/3، Members3,9 . اثنين من تنشيط R-SMADs شكل مجمعات ثلاثية في وقت لاحق مع SMAD4 الوسيط المشترك. ثم تكون مجمعات عوامل النسخ هذه قادرة على الانتقال إلى النواة وتنظيم نسخ الجينات المستهدفة. يمكن أن تتفاعل SMADs مع مجموعة متنوعة من المنشطات المشاركة النسخية المختلفة والمقمعات المشتركة ، مما يؤدي إلى تنويع إمكانيات تنظيم الجينات المستهدفة10. ولإلغاء القيود التنظيمية على إشارات الأمراض التي تسببها الأمراض الحادة آثار خطيرة في مجموعة متنوعة من الأمراض. وتمشيا مع هذا، قد يؤدي إشارات TGFβ/BMP غير المتوازنة إلى أمراض الأوعية الدموية الحادة، مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي، أو التهاب الأوعية الدموية النزفي الوراثي، أو تصلب الشرايين3،11،12،13،14.
تشكل الخلايا البطانية (ECs) الطبقة الأعمق من الأوعية الدموية ، وبالتالي ، فهي معرضة لإجهاد القص (SS) ، وهي قوة احتكاك يمارسها التدفق اللزج للدم. ومن المثير للاهتمام، يتم الاحتفاظ ECs المقيمين في أجزاء من الأوعية الدموية، والتي تتعرض لمستويات عالية من موحدة، صفح SS، في حالة الهوستاتيكية والكئيب. وعلى النقيض من ذلك، فإن المركبات ECs التي تعاني من انخفاض مستوى SS غير الموحد، على سبيل المثال، عند التشعبات أو الانحناء الأقل للقوس الأبهري، تنتشر وتفعيل المسارات الالتهابية15. وفي المقابل، فإن مواقع المركبات الإلكترونية المختلة معرضة للإصابة بالتصلب الشرايين. ومن المثير للاهتمام، أن المركبات الإلكترونية في هذه المناطق من أثيروبرون تعرض مستويات عالية بشكل شاذ من SMAD2/3 المنشط وSMAD1/516,17,18. وفي هذا السياق، تبين أن الإشارات المعززة TGFβ/BMP حدث مبكر في تطور الآفات تصلب الشرايين19 ووجد أن التداخل مع إشارات BMP يقلل بشكل ملحوظ من التهاب الأوعية الدموية، وتكوين الورم الحراري، والتكلس المرتبط به20.
القرب ربط المقايسة (جيش التحرير الشعبى الصينى) هو تقنية بيوكيميائية لدراسة التفاعلات البروتين البروتين في الموقع21،22. وهو يعتمد على خصوصية الأجسام المضادة من مختلف الأنواع التي يمكن أن تربط البروتينات المستهدفة ذات الاهتمام، مما يسمح بالكشف بشكل محدد للغاية عن تفاعلات البروتين الذاتية على مستوى الخلية الواحدة. هنا ، يجب على الأجسام المضادة الأولية أن ترتبط ب epitope الهدف على مسافة أقل من 40 نانومتر للسماح بالكشف23. لذلك ، فإن جيش التحرير الشعبي مفيد إلى حد كبير على النهج التقليدية للمناعة المشتركة ، حيث هناك حاجة إلى عدة ملايين من الخلايا للكشف عن التفاعلات البروتينية الذاتية. في جيش التحرير الشعبي، تربط الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع، المرتبطة بشكل متناقض بشظايا الحمض النووي (التي يطلق عليها مسابير Plus و Minus)، الأجسام المضادة الأولية وإذا تفاعلت البروتينات ذات الاهتمام، فإن مسابير Plus و Minus تأتي على مقربة. يتم ربط الحمض النووي في الخطوة التالية ويتم تكبير الدائرة المتداول للحمض النووي الدائري. أثناء التضخيم ، ترتبط أوليغونوكليوتيدات الفلورسنتات التكميلية بالحمض النووي المركب ، مما يسمح بتصور هذه التفاعلات البروتينية عن طريق المجهر الفلوري التقليدي.
البروتوكول الموصوف هنا يمكن العلماء من مقارنة عدد مجمعات نسخ SMAD النشطة كميا في ظروف SS atheroprotective و atheroprone في المختبر باستخدام PLA. يتم إنشاء SS عن طريق نظام مضخة هوائية قابلة للبرمجة التي هي قادرة على توليد تدفق صفح أحادي الاتجاه من مستويات محددة ويسمح زيادات تدريجية من معدلات التدفق. تسمح هذه الطريقة للكشف عن التفاعلات بين SMAD1/5 أو SMAD2/3 مع SMAD4، وكذلك المجمعات المختلطة R-SMAD. يمكن توسيعه بسهولة لتحليل تفاعلات SMADs مع المنظمين المشاركين النسخي أو إلى مجمعات عوامل النسخ بخلاف SMADs. ويبين الشكل 1 الخطوات الرئيسية للبروتوكول المعروضة أدناه.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول الموصوف. (أ) تتعرض الخلايا المصنفة في شرائح من 6 قنوات لإجهاد القص باستخدام نظام مضخة هوائية. (ب) تستخدم الخلايا الثابتة لتجربة جيش التحرير الشعبي أو لظروف التحكم. (ج) يتم الحصول على صور لتجارب جيش التحرير الشعبي مع المجهر الفلوري ويتم تحليلها باستخدام برنامج تحليل ImageJ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول القائم على جيش التحرير الشعبي الموصوف هنا طريقة فعالة لتحديد القرب من بروتينين (على سبيل المثال، تفاعلهما المباشر) في البلدان النامية المعرضة لضغوط القص بدقة كمية ومكانية. باستخدام الشرائح تدفق مع قنوات متوازية متعددة، يمكن فحص العديد من التفاعلات البروتين مختلفة في نفس …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة ماريا رايشنباخ والدكتور كريستيان هيبن على دعمهما لنظام التدفق، وإليانور فوكس ويونيون شياو على قراءة المخطوطة بشكل نقدي. تم تمويل P-L.M من قبل مدرسة ماكس بلانك الدولية للأبحاث IMPRS-البيولوجيا والحساب (IMPRS-BAC). تلقى PK التمويل من قبل DFG-SFB1444. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.
Materials
| µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
| Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
| Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
| DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
| DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
| Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
| Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
| FIJI | Image Analysis software | ||
| Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
| Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
| Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
| GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
| HUVECs | |||
| ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
| ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
| Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
| L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
| mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
| mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
| mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
| Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
| Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
| Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
| rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
| Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
| Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
References
- Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
- Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
- Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
- Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
- Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
- Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
- Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. . Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).
- Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
- Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).
- Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
- MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
- Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
- Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
- van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
- Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Alam, M. S. Proximity Ligation Assay (PLA). Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).
- Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012)
- Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019)
- ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).
- Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).
