근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화
Summary
여기서, 병리학및 생리학적 유체 전단 응력 조건에 노출된 내피 세포에서 근접 계각 분석(PLA)을 사용하여 여러 SMAD 복합체를 동시에 시각화하고 분석하는 프로토콜을 수립합니다.
Abstract
성장인자 β 변형(TGFβ)/뼈 형태유전학 단백질(BMP) 시그널링은 혈관시스템의 발달 및 항상성 동안 엄격하게 조절되고 균형을 이루며, 따라서 이 신호 경로에서 의변조절은 폐동맥 고혈압, 유전출혈성 및 혈관경화와 같은 심한 혈관 병리를 초래한다. 혈관의 가장 안쪽 층인 내피 세포(EC)는 유체 전단 응력(SS)에 지속적으로 노출됩니다. 유체 SS의 비정상적인 패턴은 TGFβ/BMP 시그널링을 향상시키는 것으로 나타났으며, 이는 다른 자극과 함께, 괴로발생을 유도한다. 이와 관련하여, 아테로경향이, 낮은 라미나르 SS는 TGFβ/BMP 신호를 향상시키는 동시에 높은 라미나르 SS를 향상시키는 것으로 밝혀졌으며, 이 신호는 감소시킨다. 이러한 경로의 활성화를 효율적으로 분석하기 위해, 우리는 상용 공압 펌프 시스템과 근접 계합 분석 (PLA)를 사용하여 낮은 라미나르 SS 및 높은 라미나르 SS 조건하에서 전사 인자 복합체의 형성을 조사하기 위해 워크플로우를 설계했습니다.
활성 TGFβ/BMP 신호는 두 개의 규제 SMADs(R-SMAD)로 구성된 트리메릭 SMAD 복합체의 형성을 필요로 한다. SMAD2/3 및 SMAD1/5/8 TGFβ 및 BMP 시그널링에 대한 각각)을 공통 중재자 SMAD(공동 SMAD; SMAD4). 트리메릭 SMAD 복합체, 즉 R-SMAD/공동 SMAD 또는 R-SMAD/R-SMAD의 상이한 하위 단위를 대상으로 하는 PLA를 사용하여 활성 SMAD 전사 인자 복합체의 형성은 형광 현미경을 사용하여 정량적으로 그리고 공간적으로 측정될 수 있다.
6개의 작은 병렬 채널이 있는 플로우 슬라이드를 사용하면 연재하여 연결할 수 있으며, 전사 인자 복합 형성 및 필요한 컨트롤의 포함에 대한 조사를 가능하게 합니다.
여기에 설명된 워크플로우는 다른 유체 SS 조건에서 SMAD가 아닌 다른 전사 인자 복합체에 대한 SMAD의 근접성을 대상으로 하는 연구에 쉽게 적응할 수 있습니다. 여기에 제시된 워크플로우는 정량적으로나 공간적으로 모두 EC에서 유도된 TGFβ/BMP 신호를 연구하는 빠르고 효과적인 방법을 보여줍니다.
Introduction
변형 성장 인자 베타 (TGFβ) 슈퍼 패밀리의 단백질은 TGFβs, 뼈 형태 유전학 단백질 (BmPs), 및 Activins1,2를 포함한 다양한 구성원을 가진 흉골 사이토카인이다. 리간드 결합은 인산화로 이어지는 수용체 올리고머의 형성을 유도하고, 이에 의해, 세포조절SMAD(R-SMAD)의 활성화를 유도한다. 리간드의 하위 패밀리에 따라 다른 R-SMAD가 활성화됩니다1,2. TGFβs 및 액티빈은 주로 SMAD2/3의 인산화를 유도하는 반면, BMP는 SMAD1/5/8 인산화를 유도합니다. 그러나, BmPs와 TGFβs/Activins는 또한 ‘측면 신호’3,4,5,6,7,8로 불리는 프로세스에서 각각다른 하위 가족의 R-SMADs를 활성화하고 SMAD1/5 및 SMAD2/3, 회원 으로 구성된 혼합 SMAD 복합체가 있다는 증거가 축적되어 있습니다. . 두 개의 활성 R-SMADs는 이후 공통 중재자 SMAD4와 트리메릭 복합체를 형성한다. 이러한 전사 인자 복합체는 핵으로 배분하고 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있습니다. SMADs는 다양한 상이한 전사 공동 활성제 및 공동 억압자와 상호 작용할 수 있으며, 표적 유전자10을 조절할 수 있는 가능성의 다양화로 이어집니다. SMAD 신호의 규제 완화는 다양한 질병에 심각한 영향을 미칩니다. 이에 따라 불균형한 TGFβ/BMP 시그널링은 폐 동맥 고혈압, 유전출혈성 혈관기암증 또는 죽상 경화증3,11,12,13,14와 같은 심한 혈관 병리로 이어질 수 있다.
내피 세포 (EC)는 혈관의 가장 안쪽 층을 형성하고, 따라서, 전단 응력 (SS),에 노출, 혈액의 점성 흐름에 의해 가해지는 마찰 력. 흥미롭게도, 균일한, 라미나르 SS의 상부에 노출되는 혈관의 부분에 거주하는 IC는, 정각적이고 정지상태에 보관됩니다. 대조적으로, 비균일한 SS를 경험하는 EC는, 예를 들면, 양면 또는 대동맥 아치의 더 적은 곡률에서, 증식하고 선동적인 통로를 활성화합니다15. 차례로, 기능 장애 PC의 사이트는 동맥 경화증을 개발하는 경향이있다. 흥미롭게도, 이러한 atheroprone 지역에 있는 EC는 활성화된 SMAD2/3 및 SMAD1/516,17,18의 비정상적으로 높은 수준을 표시합니다. 이러한 맥락에서, 향상된 TGFβ/BMP 시그널링은 동맥경화성 병변19의 개발초기 발생으로 밝혀졌으며 BMP 신호와의 간섭은 혈관 염증, 무종 형성 및 관련 석회화20을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
근접 결찰 분석법(PLA)은 situ21,22에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 생화학 적 기술입니다. 그것은 관심있는 표적 단백질을 결합할 수 있는 상이한 종의 항체의 특이성에 의존하여 단일 세포 수준에서 내인성 단백질 상호 작용의 매우 특이적인 검출을 허용합니다. 여기서, 1차 항체는 검출을 허용하기 위해 40nm 미만의 거리에서 표적 에피토프에 결합해야 한다.23. 따라서 PLA는 내인성 단백질 상호 작용을 감지하기 위해 수백만 개의 세포가 필요한 전통적인 공동 면역 침전 접근 에 크게 유용합니다. PLA에서, 종 특정 이차 항체는, DNA 단편에 공유하게 연결됩니다 (플러스와 마이너스 프로브라고 합니다), 1 차적인 항체를 묶고 관심의 단백질이 상호 작용하는 경우에, 플러스와 마이너스 프로브는 가까이에 옵니다. DNA는 다음 단계에서 결찰되고 원형 DNA의 롤링 원 증폭이 가능하게 된다. 증폭 하는 동안, 형광 표지 보완 올리고 뉴클레오티드 합성 된 DNA에 바인딩, 이러한 단백질 상호 작용을 허용 하는 기존의 형광 현미경 검사법에 의해 시각화 될 수.
여기에 설명된 프로토콜은 과학자들이 PLA를 사용하여 시험관내 의 에로히어로프로텍션 및 아로테경향이 있는 SS 조건에서 활성 SMAD 전사 복합체의 수를 정량적으로 비교할 수 있게 합니다. SS는 정의된 레벨의 라미나르 단방향 흐름을 생성할 수 있고 유량의 단계별 증가를 허용하는 프로그래밍 가능한 공압 펌프 시스템을 통해 생성됩니다. 이 방법을 사용하면 SMAD1/5 또는 SMAD2/3과 SMAD4 및 혼합 R-SMAD 복합체 간의 상호 작용을 감지할 수 있습니다. SMAD와 전사 공동 규제 기관과의 상호 작용을 분석하거나 SMAD 이외의 전사 인자 복합체로 쉽게 확장할 수 있습니다. 그림 1 은 아래에 제시된 프로토콜의 주요 단계를 보여 주세요.
그림 1: 설명된 프로토콜의 회로도 표현입니다. (A) 6채널 슬라이드에서 시드된 셀은 공압 펌프 시스템으로 전단 응력에 노출된다. (B) 고정 셀은 PLA 실험 또는 제어 조건에 사용됩니다. (C) PLA 실험의 이미지는 형광 현미경으로 획득하고 ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 PLA 기반 프로토콜은 정량적 및 공간 해상도를 가진 전단 응력에 노출된 IC에서 두 가지 단백질(예를 들어, 그들의 직접적인 상호 작용)의 근접성을 결정하는 효율적인 방법을 제공합니다. 여러 병렬 채널을 가진 유량 슬라이드를 사용하여 동일한 기계적 조건하에서 세포에서 동시에 여러 가지 단백질 상호 작용을 검사 할 수 있습니다. 대조적으로, 사용자 정의 빌드 흐름 챔버 시스?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 마리아 라이헨바흐 박사와 크리스티안 히펜 박사가 흐름 설정 시스템에 대한 지원에 감사를 표하고 엘리너 폭스와 윤윤 샤오는 원고를 비판적으로 읽었습니다. P-L.M. 국제 막스 플랑크 연구 학교 IMPRS 생물학 및 계산에 의해 투자되었다 (IMPRS-BAC). PK는 DFG-SFB1444에 의해 자금을 받았다. 그림 1은 BioRender를 사용하여 만들어졌습니다.
Materials
| µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
| Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
| Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
| DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
| DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
| Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
| Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
| FIJI | Image Analysis software | ||
| Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
| Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
| Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
| GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
| HUVECs | |||
| ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
| ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
| Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
| L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
| mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
| mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
| mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
| Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
| Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
| Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
| rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
| Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
| Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
References
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