Visualisering og kvantificering af TGFβ/BMP/SMAD Signalering under forskellige væskeforskydningsstress ved hjælp af proximity-ligation-assay

Proteiner af de transformerende vækstfaktorer beta (TGFβ) superfamily er pleiotropiske cytokiner med en række medlemmer, herunder TGFβs, knoglemorfogenetiske proteiner (BMB’er) og ^Activins1,2. Ligandbinding fremkalder dannelsen af receptor oligomerer, der fører til fosforylering og dermed aktivering af cytosolic reguleringsmæssig SMAD (R-SMAD). Afhængigt af ligandernes underfamilie aktiveres forskellige R-SMAD’er1,2. Mens TGFβs og Activins hovedsagelig fremkalder fosforylering af SMAD2/3, fremkalder BMB’er SMAD1/5/8 fosforylering. Der er imidlertid akkumulerende beviser for, at BMPs og TGFβs/Activins også aktiverer R-SMAD’er for den respektive anden underfamilie i en proces, der betegnes som »lateral signalering«3,4,5,6,7,8^, og at der er blandede SMAD-komplekser bestående af både SMAD1/5 og SMAD2/3, ^medlemmer3,9 . To aktiverede R-SMAD’er danner efterfølgende trimeriske komplekser med den fælles mægler SMAD4. Disse transskription faktor komplekser er derefter i stand til at translokere ind i kernen og regulere transskription af mål gener. SMAD’er kan interagere med en række forskellige transskriptionskoaktiveringatorer og co-repressorer, hvilket fører til diversificering af mulighederne for at regulere ^målgener10. Deregulering af SMAD-signalering har alvorlige konsekvenser for en række sygdomme. I overensstemmelse med dette, ubalanceret TGFβ/BMP signalering kan føre til alvorlige vaskulære patologier, såsom lungepulsåren hypertension, arvelig hæmoragisk telangiectasia, eller åreforkalkning3,11,12,13,14.

Endotelceller (ECs) danner det inderste lag af blodkar og udsættes derfor for forskydningsstress (SS), en friktionskraft udøvet af blodets tyktflydende strøm. Interessant nok holdes ECs, der er bosiddende på de dele af vaskulaturen, som udsættes for høje niveauer af ensartet, laminar SS, i en homøostatisk og quiescent tilstand. I modsætning hertil er ECs, der oplever lav, ikke-ensartet SS, f.eks. ved bifurcations eller den mindre krumning af aortabuen, proliferative og aktiverer inflammatoriske ^veje15. Til gengæld er steder med dysfunktionelle ECs tilbøjelige til at udvikle åreforkalkning. Interessant nok viser ECs i disse atheroprone områder afvigende høje niveauer af aktiveret SMAD2/3 og SMAD1/516,17,18. I denne sammenhæng viste det sig, at forbedret TGFβ/BMP-signalering var en tidlig hændelse i udviklingen af aterosklerotiske ^læsioner19, og interferens med BMP-signalering viste sig at reducere vaskulær betændelse, ateromadannelse og tilhørende ^{forkalkning20}.

Proximity Ligation Assay (PLA) er en biokemisk teknik til at studere protein-protein interaktioner in ^situ21,22. Det er afhængig af specificiteten af antistoffer af forskellige arter, der kan binde målproteiner af interesse, hvilket giver mulighed for meget specifik påvisning af endogene proteininteraktioner på et enkeltcellet niveau. Her skal primære antistoffer binde sig til deres mål epitope i en afstand af mindre end 40 nm for at give mulighed for ^detektion23. Derfor er PLA i høj grad gavnlig i forhold til traditionelle co-immunprecipitation tilgange, hvor flere millioner celler er nødvendige for at opdage endogene protein interaktioner. I PLA binder artsspecifikke sekundære antistoffer, der er kovalent forbundet med DNA-fragmenter (såkaldte Plus- og Minus-sonder), de primære antistoffer, og hvis interesseproteinerne interagerer, kommer Plus- og Minus-sonder tæt på. DNA’et bliver ligated i det følgende trin, og den rullende cirkelforstærkning af det cirkulære DNA er muliggjort. Under forstærkning binder fluorescerende mærkede komplementære oligoukleotider sig til det syntetiserede DNA, hvilket gør det muligt at visualisere disse proteininteraktioner ved konventionel fluorescensmikroskopi.

Den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt for forskere kvantitativt at sammenligne antallet af aktive SMAD transskriptionskomplekser ved atheroprotive og atheroprone SS-tilstande in vitro ved hjælp af PLA. SS genereres via et programmerbart pneumatisk pumpesystem, der er i stand til at generere laminar ensrettet strøm af definerede niveauer og tillader trinvise stigninger i flowhastigheder. Denne metode gør det muligt at påektionere interaktioner mellem SMAD1/5 eller SMAD2/3 med SMAD4 samt blandede R-SMAD-komplekser. Det kan nemt udvides til at analysere interaktioner af SMADs med transskriptionelle medregulatorer eller til transskriptionsfaktorkomplekser bortset fra SMAD’er. Figur 1 viser de vigtigste trin i protokollen nedenfor.

Figur 1: Skematisk repræsentation af den beskrevne protokol. (A) Celler, der er sået i 6-kanals dias, udsættes for forskydningsstress med et pneumatisk pumpesystem. (B) Faste celler anvendes til PLA-eksperiment eller til kontrolbetingelser. (C) Billeder af PLA eksperimenter er erhvervet med en fluorescens mikroskop og analyseres ved hjælp af ImageJ analyse software. Klik her for at se en større version af dette tal.