Producción de células CAR-T humanas diseñadas por CRISPR

La terapia con receptores de antígenos quiméricos (CAR)-células T ha revolucionado el campo de las terapias celulares adoptivas y la inmunoterapia contra el cáncer. Las células CAR-T son células T modificadas que expresan un receptor inmune sintético que combina un fragmento de anticuerpo de cadena única específico del antígeno con dominios de señalización derivados de la cadena TCRzeta y dominios coestimuladores necesarios y suficientes para la activación y coestimulación de las células T^1,2,3,4 . La fabricación de células CAR-T comienza por la extracción de las propias células T del paciente, seguida de la transducción viral ex vivo del módulo CAR y la expansión del producto de células CAR-T con perlas magnéticas que funcionan como células presentadoras de antígenos artificiales⁵. Las células CAR-T expandidas se vuelven a infundir en el paciente donde pueden injertarse, eliminar las células tumorales diana e incluso persistir durante varios años después de la infusión^6,7,8. Aunque la terapia con células CAR-T ha dado lugar a tasas de respuesta notables en neoplasias malignas de células B, el éxito clínico de los tumores sólidos ha sido desafiado por múltiples factores, incluida la mala infiltración de células T^9,un microambiente tumoral inmunosupresor^10,cobertura y especificidad de antígenos, y disfunción de células CAR-T^11,12 . Otra limitación de la terapia actual de células CAR-T incluye el uso de células T autólogas. Después de múltiples rondas de quimioterapia y una alta carga tumoral, las células CAR-T pueden ser de mala calidad en comparación con los productos CAR-T alogénicos de donantes sanos, además del tiempo y los gastos asociados con la fabricación de células CAR-T autólogas. La edición genética del producto de células CAR-T por CRISPR/Cas9 representa una nueva estrategia para superar las limitaciones actuales de las células CAR-T^{13,14,15,16,17.}

CRISPR/Cas9 es un sistema de dos componentes que se puede utilizar para la edición dirigida del genoma en células de mamíferos^18,19. La endonucleasa asociada a CRISPR Cas9 puede inducir roturas de doble cadena específicas del sitio guiadas por pequeños ARN a través del emparejamiento de bases con la secuencia de ADN objetivo²⁰. En ausencia de una plantilla de reparación, las roturas de doble hebra se reparan mediante la vía de unión final no homóloga propensa a errores (NHEJ), lo que resulta en mutaciones de desplazamiento de marco o codones de parada prematuros a través de mutaciones de inserción y deleción (INDELs)^19,20,21. La eficiencia, la facilidad de uso, la rentabilidad y la capacidad de edición del genoma multiplex hacen de CRISPR/Cas9 una poderosa herramienta para mejorar la eficacia y seguridad de las células CAR-T autólogas y alogénicas. Este enfoque también se puede utilizar para editar células T dirigidas por TCR reemplazando la construcción CAR con una TCR. Además, las células CAR-T alogénicas que tienen un potencial limitado para causar la enfermedad de injerto contra huésped también se pueden generar mediante la edición de genes del locus TCR, b2m y HLA.

En este protocolo, mostramos cómo la ingeniería CRISPR de las células T se puede combinar con la entrega mediada por vectores virales del CAR-Transgene para generar productos de células CAR-T editadas por el genoma con mayor eficacia y seguridad. Un diagrama esquemático de todo el proceso se muestra en la Figura 1. Utilizando este enfoque, hemos demostrado la eliminación de genes de alta eficiencia en células CAR-T humanas primarias. La Figura 2A describe en detalle la línea de tiempo de cada paso para editar y fabricar células T. También se discuten estrategias para el diseño de ARN guía y la validación eliminación para aplicar este enfoque a varios genes objetivo.