인간 CRISPR-엔지니어링 CAR-T 셀 생산
Summary
여기서, 우리는 CAR-T 세포를 수정하기 위하여 CRISPR Cas 기술을 사용하여 1 차적인 인간 T 세포에 있는 유전자 편집을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)를 이용한 입양 세포 치료는 혈액학적 악성 종양 환자에서 놀라운 임상 효능을 입증했으며 현재 다양한 고형 종양에 대한 조사를 받고 있습니다. CAR-T 세포는 환자의 혈액에서 T 세포를 제거하고 표적 종양 세포를 인식하고 제거하기 위해 T 세포를 리디렉션합성 면역 수용체를 발현하도록 엔지니어링하여 생성됩니다. CAR-T 세포의 유전자 편집은 현재 CAR-T 세포 치료의 안전성을 개선하고 CAR-T 세포의 효능을 더욱 증가시킬 가능성이 있습니다. 여기에서는 인간 CRISPR 에서 설계한 CD19 지향 CAR-T 세포의 활성화, 확장 및 특성화에 대한 방법을 설명합니다. 이는 CAR 렌티바이러스 벡터의 트랜스듀션및 단일 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas9 엔도누셀의 사용을 T 세포에 대한 관심있는 유전자를 표적으로 하는 것으로 구성된다. 이 프로토콜에 기술된 방법은 이 연구를 위해 사용된 것 이외에 그밖 CAR 구조 및 표적 유전자에 보편적으로 적용될 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 gRNA 설계를 위한 전략을, 리드 gRNA 선택 및 임상급 인간 T 세포의 고효율, 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 공학을 재현가능하게 달성하기 위한 표적 유전자 녹아웃 검증에 대해 설명합니다.
Introduction
키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 치료제는 입양세포 치료 및 암 면역요법 분야에 혁명을 일으켰습니다. CAR-T 세포는 T-세포 활성화 및 공동 자극1,2,3,4에 필요한 TCRzeta 사슬 및 비용 발생 도메인에서 파생된 신호 도메인과 항원 특이적 단일 사슬 항체 단편을 결합하는 합성 면역 수용체를 발현하는 T-세포설계 . CAR-T 세포의 제조는 환자의 T 세포를 추출하는 것으로 시작하여 CAR 모듈의 전 생체 바이러스 성 트랜스포 변환 및 인공 항원 제시 세포로 작동하는 자기 구슬로 CAR-T 셀 제품의 확장에 선행된다5. 확장된 CAR-T 세포는 이식할 수 있는 환자로 재주입되어 표적 종양 세포를 제거하고 주입6,7,8까지다년간 지속된다. CAR-T 세포 치료는 B 세포 악성 종양에서 놀라운 반응률을 초래했지만, 고형 종양에 대한 임상 성공은 가난한 T 세포 침투9,면역 억제 종양 미세 환경10,항원 커버리지 및 특이성 및 CAR-T 세포 기능 장애11,12를 포함한 여러 요인에 의해 도전되었습니다. . 현재 CAR-T 세포 치료의 또 다른 제한은 자가 T 세포의 사용을 포함한다. 화학요법과 높은 종양 부담의 다발 후에, CAR-T 세포는 자가 CAR-T 세포의 제조와 관련되었던 시간 및 비용 이외에 건강한 기증자에서 동종 CAR-T 제품에 비해 나쁜 질일 수 있습니다. CRISPR/Cas9에 의한 CAR-T 세포 제품의 유전자편집은 CAR-T 세포13,14,15,16,17의현재 한계를 극복하기 위한 새로운 전략을 나타낸다.
CRISPR/Cas9는 포유류세포(18,19)에서표적 게놈 편집에 사용될 수 있는 2개의 성분 시스템이다. CRISPR-관련 엔도누블레스 Cas9은 표적 DNA서열(20)과염기 페어링을 통해 작은 RNA에 의해 유도된 사이트 별 이중 가닥 브레이크를 유도할 수 있다. 수리 템플릿이 없는 경우, 이중 가닥 파손은 오차경향이 있는 비homologous end 결합(NHEJ) 경로에 의해 수리되며, 삽입 및 삭제 돌연변이(INDELs)19,20,21을통해 프레임 시프트 돌연변이 또는 조기 정지 코돈의 결과로 된다. 효율성, 사용 용이성, 비용 효율성 및 멀티플렉스 게놈 편집 능력은 CRISPR/Cas9를 자가 및 동종 CAR-T 세포의 효능과 안전성을 향상시키는 강력한 도구입니다. 이 방법은 CAR 구조를 TCR로 대체하여 TCR 지시 T 셀을 편집하는 데도 사용할 수 있습니다. 또한, 숙주 질병 대 접목을 일으킬 수 있는 잠재력이 제한된 동종 CAR-T 세포는 또한 TCR, b2m 및 HLA 궤적을 편집하는 유전자에 의해 생성될 수 있다.
이 프로토콜에서, 우리는 T 세포의 CRISPR 공학이 향상된 효험과 안전성을 가진 게놈 편집 CAR-T 세포 제품을 생성하기 위하여 CAR-Transgene의 바이러스 벡터 매개 납품과 결합될 수 있는 방법을 보여줍니다. 전체 프로세스의 회로도도는 그림 1에표시됩니다. 이 접근을 사용하여, 우리는 1 차적인 인간 CAR-T 세포에 있는 고효율 유전자 녹아웃을 보여주었습니다. 그림 2A는 T 셀 편집 및 제조를 위한 각 단계의 타임라인을 자세히 설명합니다. 가이드 RNA 설계 및 녹아웃 검증을 위한 전략은 또한 각종 표적 유전자에 이 접근을 적용하기 위하여 토론됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 CRISPR Cas9 기술을 사용하여 CAR-T 세포를 유전자 편집하고 기능과 효능을 더 테스트하기 위해 제품을 제조하는 접근법을 설명합니다. 상기 프로토콜은 키메라 항원 수용체를 가진 엔지니어링 T 세포와 결합된 1차 인간 T 세포에서 CRIPSR 유전자 편집을 수행하기 위해 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 최소한의 기증자- 기증자- 기증자 가변성으로 높은 녹아웃 효율성을 허용합니다. CRI…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 펜실베니아 대학의 정상적인 기증자 T 세포와 흐름 세포 측정 코어를 제공하는 인간 면역학 코어를 인정합니다.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
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