此工作流程可用于使用囊性纤维化个体肺部细菌生物膜的既定前活体模型进行抗生素易感性测试。使用此模型可以提高MBEC(最低生物膜根除浓度)检测的临床有效性。
抗生素的有效处方,目前存在于囊性纤维化(CF)的个人肺部细菌生物膜,是有限的抗生素易感性测试(AST)结果使用标准诊断方法(如肉汤微分,磁盘扩散,或Etest)和抗生素治疗后的临床结果之间的不良相关性。通过使用现成的生物膜生长平台改进 AST 的尝试显示效果几乎没有改善。体外生物膜系统模仿CF肺的物理化学环境的能力有限,因此细菌生理学和生物膜结构也阻碍了CF感染新疗法的发现。在这里,我们提出了一个协议,执行CF病原体的AST成长为成熟,在体内一样的生物膜,在一个前体内CF肺模型,由猪支气管组织和合成CF痰(前活体猪肺,EVPL)。
使用标准实验室介质或微粒板中合成 CF 痰的各种配方,存在多个体外检测生物膜易感性测试。生长介质和生物膜基板(聚苯乙烯板与支气管组织)都可能影响生物膜抗生素耐受性。我们表现出对临床伪肌氨酸和金黄色葡萄球菌分离的耐受性增强,抗生素治疗生物膜的效果与标准微分液测定中的最低抑制浓度(MIC)或磁盘扩散测定中的敏感/耐药性分类无关。
前活体平台可用于患者样本的定制生物膜 AST,并作为药物研发过程中潜在抗生物膜制剂的增强测试平台。通过使用更多类似体内的测试平台,改善抗生物膜药物的处方或加速发现,可以大大改善CF患者的健康结果,并降低临床治疗和发现研究的成本。
慢性生物膜感染影响正常免疫防御能力受损的个人。有风险的群体包括那些有遗传条件囊性纤维化(CF)1。在婴儿期早期呼吸道中异常厚的粘液的殖民化导致支气管2、3的难以解决的生物膜感染。细菌作为广泛基质封装生物膜的生长是区分免疫功能低下的人的慢性感染与健康宿主的急性感染的一个因素,生物膜状态既保护细菌免受抗生素接触(由于通过基质的扩散减少),并降低其抗生素易感性(例如,通过诱导静默或上调节的排泄泵)4,5。然而,宿主组织生理学和化学的疾病特异性变化进一步改变了急性感染或标准实验室生长条件下观察到的细菌生理学。CF的主要例子包括使用不寻常的碳源,如脂肪酸和氨基酸从肺表面活性剂释放出来,由粘液的微生物降解产生,微量营养素的释放,如从受损组织的铁,和微生物6,7,8。
因此,特定生物膜感染环境中的特定物理化学条件会影响对抗生素的反应。首先,细胞外基质的结构和深度取决于当地的环境条件,如养分或剪切力。其次,环境线索可以触发特定抗生素耐药基因的表达。例如,CF病原体伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨显示β-乳糖酶的表达增加,在CF痰中与体外9的毛刺表达减少,而另一个CF病原体,伯克霍尔迪亚塞诺塞帕西亚,在CF痰10中生长时,会调节β-乳酸酶和浮游泵。第三,宿主条件可以提示生理或遗传切换到抗生素耐药表型,这是很难在体外重述。其中包括CF病原体金黄色葡萄球菌11,12的小菌落变种。
所有这些数据都表明,当诊断实验室将单个克隆从致病生物膜中分离出来,并在标准实验室介质(肉汤微分化、磁盘扩散或 Etest)中对浮石或阿加板生长培养物执行 AST 时,结果通常无法预测哪些抗生素在体内实际有效。即使使用体外生物膜检测,由于所使用的介质和附件表面的差异,它们可能不会提示体内样的生物膜表型,因此使用流动细胞或高通量微板平台的检测可以高估抗生素敏感性13。同样的问题也适用于寻求开发新的抗生物膜制剂的学术界和工业界的研究人员:使用体外平台(如流细胞、微电板或疾病控制中心生物膜反应器)测试药物潜力可能会使生物膜疗效过低,并在研究、开发管道中产生误报。
在CF抗生素治疗后,AST结果与临床结果之间的不良相关性是众所周知的。许多临床医生只是忽略诊断实验室 AST,因为没有统一的 CF 特定指南来解释这些结果,而是根据具体情况做出处方决定。已尝试使用卡尔加里生物膜装置改进CF AST,该装置使用生长在含有标准AST介质(如经冰毒调整的穆勒-欣顿肉汤)14、15的微板井内塑料钉表面的生物膜。与标准浮石AST16相比,这种检测在预测哪些抗生素在体内起作用方面没有更好的效果。CF患者受到的影响是明显的。尽管反复使用抗生素(定期吸入抗生素,中位数为27天/年接受静脉注射抗生素的个人与CF在英国)17,频繁和不可预知的急性肺恶化事件导致渐进性肺损伤,并在大约90%的情况下,死于呼吸衰竭。在最近的一项分析中,细菌性肺部感染是CF中药物成本的最强预测,平均每年增加3.6万欧元/患者,直接医疗费用为18,19。
对于其他健康个体的急性感染,目前的研究和政策侧重于快速AST的基础上,例如,护理点基因组预测是理想的20。但是,在慢性CF感染的情况下,显然需要一种不同的方法:在宿主模拟模型中实施AST,以更好地回顾体内环境和病原代谢状态,并允许形成逼真的生物膜结构。
我们以前已经开发了一个CF生物膜模型,包括部分猪支气管在合成CF痰中孵育,并感染了P.阿鲁吉诺萨或金黄色葡萄球菌。未受感染的EVPL保留正常的组织病理学7天,但P.aeruginosa和S.Aureus的实验室或临床隔离物可重复地在组织周围形成类似体内的聚合物,模仿CF感染21、22、23的病因。我们提出了一个协议,使用这种高有效性,高通量模型作为量身定制的生物膜AST平台的CF和目前的示范性结果,显示病原体生物膜对临床使用的抗生素的高耐受性,当在模型中成长。该模型可以很容易地纳入研究、开发管道,用于管理或预防生物膜的形成,并有可能纳入AST诊断。大多数使用的设备(见材料表)可能很容易在典型的微生物实验室找到,虽然珠子打手是必不可少的,我们已经发现,从与合作者的工作,一个合适的紫外线杀菌柜可能也需要采购。由于肺源来自商业屠宰场或屠宰场,因此该模型没有道德问题。
前活体肺模型的吞吐量高,价格低廉,而且由于它使用肉类行业的后消费者废物,因此没有道德问题。它旨在模仿长期感染的人类 CF 气道比目前可用的体外 AST 平台更好。这里介绍的结果表明,在这种情况下,它可以更准确地预测抗生素易感性。
协议中的关键步骤,将确保可靠和可重复的结果包括以下:
该协议产生了一个强大的原型模型,用于 与P.aeruginosa,有很大的发展潜力,用于 与S.Aureus,但它确实有一些限制,将需要解决某些应用程序在未来。组织是从单一的菌落接种,以允许克隆人的发展。结果表明,对于 P.阿鲁吉诺萨来说,这对48小时时的细胞数量影响甚微。然而, 在金黄色葡萄球菌 的细菌负荷中观察到更大的变异性,鉴于不同的细菌在模型中可能生长不同,标准化的开始接种和对相同大小和重量的组织样本的严格生产可能取决于研究的有机体。由于精确解剖/感染技术或本地猪种/陆地测量的差异,实验室之间也可能存在差异。为了评估细菌种群对模型个体实施的可重复性,我们建议使用可重复性计算作为结果 25 统计分析的一部分,并使用基于试点实验的可重复性/功率计算来计算最终实验中使用的最佳样本量。
EVPL 与传统板检测相比,其主要优点之一是,它允许在宿主环境中和细胞分化中对生长浮游生物或生物表面的细菌进行测试,而不是进行空间结构。这对于考虑物理化学和营养梯度对抗菌剂活性的影响,以及在慢性感染和细菌之间的细胞-细胞相互作用的不同微环境下提供和提供活性疗法具有重要影响。后一点特别重要,因为多物种感染在CF中经常观察到,并且对与其他呼吸系统疾病相关的感染(如哮喘和慢性阻塞性肺病)越来越重要。有可能开发此模型的 AST 为个性化患者痰样本在临床诊断。一项类似的试验已经开始使用外体内伤口模拟模型进行生长和慢性伤口脱脂生物膜的AST(德克萨斯州卢伯克的西南区域伤口护理中心,R.沃尔科特博士)。
此外,该模型使用验尸组织,因此宿主免疫反应对抗生素易感性的影响有限。当前体外模型也不考虑宿主免疫反应,因此我们不认为这是 AST 应用中未来使用该模型的障碍。但是,在确定药动力学和药理动力学参数以及抗生素服用指南时,会考虑免疫反应。虽然我们的研究表明,残余免疫细胞和组织内的反应23( 和S.Azimi,个人沟通),这是一个主要领域,进一步优化和发展模型,如果更大的匹配体内条件是需要的。
为 CF 提供更临床有效的 AST 将有助于满足 2008 年英国《健康、社会护理法案》的一项关键建议,即”应制定程序,确保谨慎开处方和进行抗菌管理”。我们相信EVPL是一个理想的候选模型,以帮助满足这一需求。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢所有合著者在原论文中取得的模范成果。这项工作由MRC新调查员研究资助(授予FH 的MR/R001898/1号赠款):由 BBSRC 中部地区综合生物科学培训伙伴关系 (MIBTP) 授予 NEH 和 IA 的博士生奖学金;并由华威大学本科生研究支持计划颁发给FA进行暑假研究项目。我们感谢史蒂夫奎格利,儿子(库宾顿,沃里克郡)和约翰泰勒,儿子(厄尔斯登,考文垂)提供肺。我们还要感谢沃里克大学生命科学学院媒体准备设施的帮助,特别感谢塞里斯·哈里斯和卡罗琳·斯图尔特,以及沃里克抗菌筛选设施的安妮塔·凯瑟琳的帮助。
0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached | |||
24-well culture plates | |||
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment | |||
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium) | |||
Agarose | |||
Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs. | |||
Bead beater designed to take 2 mL tubes | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system |
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates | Diversified Biotech | BEM-1 or BERM-2000 | |
Bunsen burner | |||
Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol. | |||
Coolbox to transport lungs to lab | |||
Dissection scissors in different sizes | |||
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | |||
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes | Thermo Fisher | 15545809 | |
Fisherbrand 2.38 mm metal beads | Thermo Fisher | 15505809 | |
Germicidal UV cabinet | |||
Insulin syringes - 0.5 mL with 29G needle attached. | VWR | BDAM324892 | |
Large pallet knife | |||
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate | |||
Mounted razor blades | |||
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit | Thermo Fisher | 10474415 | For filter-sterilizing SCFM |
Petri dishes | |||
Phosphate-buffered saline | |||
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface | |||
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | |||
SCFM ingredients as listed in Table S1 | |||
Selection of forceps (blunt tips recommended) | |||
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required. | |||
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies. |