JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
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면역학 및 감염병학

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

Published: January 22, 2021
doi:
10.3791/62187
, , , , ,
1School of Life Science,University of Warwick, 2Institute of Microbiology and Infection,University of Birmingham, 3Warwick Antimicrobial Screening Facility, School of Life Science,University of Warwick

Summary

이 워크플로우는 낭포성 섬유증을 가진 개별의 폐에 있는 세균성 생물막의 확립된 ex vivo 모형을 사용하여 항생제 감수성 시험을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 모델의 사용은 MBEC의 임상 타당성을 향상시킬 수 (최소한의 생물 막 박멸 농도) 에세이.

Abstract

낭포성 섬유증(CF)을 가진 개인의 폐 내에 존재하는 세균성 생물막에 대한 항생제의 효과적인 처방은 표준 진단 방법(예를 들어, 국물 미세 희석, 디스크 확산, 또는 Etest) 및 항생제 치료 후 임상 결과를 사용하여 항생제 감수성 검사(AST) 결과 사이의 상관관계가 열악한 것에 의해 제한됩니다. 기성 생물막 성장 플랫폼을 사용하여 AST를 개선하려는 시도는 결과에 거의 개선되지 않습니다. 체외 생물막 시스템의 제한된 능력은 CF 폐의 물리화학적 환경을 모방하고, 따라서 세균 생리학 및 생물막 아키텍처, 또한 CF 감염을 위한 새로운 치료법의 발견에 제동역할을 한다. 여기서, 돼지 기관지 조직과 합성 CF 가래(ex vivo pig lung, EVPL)로 구성된 생체 내 CF 폐 모델에서 성숙하게 자란 CF 병원체의 AST를 수행하는 프로토콜을 제시한다.

마이크로티터 플레이트의 표준 실험실 매체 또는 합성 CF 가래의 다양한 제형을 사용하여 생물막 감수성 테스트를 위해 여러 가지 시험관 내 분해제가 존재합니다. 성장 배지 및 생물막 기질 (폴리스티렌 플레이트 대 기관지 조직) 모두 생물 막 항생제 내성에 영향을 미칠 가능성이 높습니다. 우리는 전 생체 모델에서 분리 된 임상 슈도모나스 아루기노사 및 황색 포도상 구균의 향상된 내성을 보여줍니다; 생물막의 항생제 치료의 효과는 표준 미세 희석 분석기또는 디스크 확산 분석에서 민감/내성 분류에서 최소 억제 농도(MIC)와 상관관계가 없습니다.

ex vivo 플랫폼은 환자 샘플의 맞춤형 바이오필름 AST와 제약 연구 및 개발 중 잠재적 인 항바이오 필름 제제를위한 향상된 테스트 플랫폼으로 사용될 수 있습니다. 생체 내 유사 테스트 플랫폼을 사용하여 항바이오필름 신약 발견의 처방 또는 가속을 개선하면 CF를 가진 개인의 건강 결과를 크게 개선할 뿐만 아니라 임상 치료 및 발견 연구 비용을 절감할 수 있습니다.

Introduction

만성 생물막 감염은 정상적인 면역 방어가 손상된 개인에 영향을 미칩니다. 위험에 있는 단은 유전 상태 낭포성 섬유증을 가진 그 (CF)1을포함합니다. 초기 유년기에 호흡기내의 비정상적으로 두꺼운 접착점액의 식민지화는 기관지2,3의난치성 생물막 감염으로 이어집니다. 광범위한 매트릭스 캡슐화된 생물막으로 박테리아의 성장은 건강한 숙주의 급성 감염으로부터 면역 손상된 사람들의 만성 감염을 구별하고 생물막 상태는 모두 항생제 노출로부터 박테리아를 보호하고 (매트릭스를 통한 감소된 확산으로 인한) 항생제 감수성을 감소시키는 한 가지 요인입니다(예를 들어, 퀼스의 유도 또는 최대규제)를감소시킴이4. 그러나, 호스트 조직 생리학 및 화학에 있는 질병 특정 변경은 급성 감염에서 또는 표준 실험실 성장 조건에서 관찰된 그것에서 세균성 생리학을 더 변경합니다. CF의 주요 예로는 폐 계면활성제에서 방출되고 무친의 미생물 분해에 의해 생성되고, 손상된 조직에서 철과 같은 미량 영양소의 방출, 미생물로 바이오시스6,7,8과같은 특이한 탄소 공급원의 사용이 포함된다.

특정 생물막 감염 맥락에서 특정 물리 화학 조건은 그러므로 항생제에 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 첫째, 세포외 매트릭스의 구조와 깊이는 영양소 또는 전단력과 같은 지역 환경 조건에 따라 달라집니다. 둘째, 환경 단서는 특정 항생 저항 유전자의 발현을 시작할 수 있습니다. 예를 들어, CF 병원균 슈도모나스 아에루기노사는 CF 가래와 시험관내 9에서포린의 발현이 증가하고, 또 다른 CF 병원체인 버크홀더리아 체노케파시아는CF sputum10에서재배할 때 베타-락타마제 및 efflux 펌프를 상향 조절한다. 셋째, 숙주 조건은 시험관내에서 되풀이하기 어려운 항생제 내성 표현형으로 생리학적 또는 유전적 전환을 큐에 할 수 있습니다. 이들은 CF 병원체 황색포도상구균의작은 식민지 변종을포함11,12.

이러한 모든 데이터는 진단 실험실이 병원성 생물막에서 개별 클론을 분리하고 표준 실험실 미디어 (국물 미생물, 디스크 확산 또는 Etest)에서 판자 또는 한고판 재배 배양에 AST를 수행 할 때, 결과는 종종 생체 내에서 작동하는 항생제를 예측하지 않는다는 것을 나타냅니다. 시험관 내 생물막 분석이 사용되는 경우에도, 사용된 배지 및 부착 표면의 차이로 인해 생체 내 생물막 표현형을 큐에 넣지 않을 수 있으므로 유량 세포 또는 고처리량 마이크로플레이트 플랫폼을 이용한 분석은 항생제민감도(13)를과대 평가할 수 있다. 새로운 항바이오막제 개발을 모색하는 학계 및 업계의 연구자에게도 동일한 문제가 적용됩니다: 유동 세포, 미세화판 또는 질병통제 생물막 반응기 센터와 같은 체외 플랫폼을 사용하여 약물 전위를 테스트하면 생물막 효능 막대를 너무 낮게 설정하고 연구, 개발 파이프라인에서 거짓 긍정을 생성할 수 있습니다.

CF에서 항생제 치료 후 AST 결과와 임상 결과 사이의 가난한 상관 관계는 잘 알려져 있다. 많은 임상의는 단순히 진단 실험실 AST를 무시 이러한 결과 해석에 대 한 균일 한, CF 특정 지침 대신 처방에 대 한 사례별 결정을. 표준 AST 배지(예: 양이온 조정 뮬러-힌튼 국물)를 포함하는 마이크로 플레이트의 우물 내에 설정된 플라스틱 페그 표면에서 자란 생물막을 사용하는 캘거리 생물막 장치를 사용하여 CF AST를 개선하기 위한 시도가 이루어졌다( 예를 들어, 양이온 조정 뮬러-힌튼 국물)14,15. 이 분석체는 표준 판자 AST16보다생체 내에서 어떤 항생제가 작동할지 예측하는 데 더 낫지 않습니다. CF를 가진 환자에 미치는 영향은 스탁입니다. 반복된 항생제 투여에도 불구하고 (일반 흡입 항생제와 영국에서 CF를 가진 개인에 대한 정맥 항생제를 수신하는 27 일 / 년의 중앙값)17,급성 폐 악화의 빈번하고 예측할 수없는 에피소드는 점진적 인 폐 손상으로 이어지고, 약 90 %의 경우, 호흡 부전으로 사망. 최근 분석에서 세균성 폐 감염은 CF에서 약물 비용의 가장 강력한 예측자였으며, 의료 비를 직접 치료비용18,19에평균 €3.6K/환자/연도에 추가했다.

그렇지 않으면 건강한 개인의 급성 감염의 경우, 예를 들어, 배려게놈 예측에 근거를 둔 급속한 AST에 집중하는 현재연구 및 정책은 이상적이다20. 그러나 만성 CF 감염의 경우, 다른 접근 이 필요하다는 것이 분명하다 : 더 나은 생체 환경과 병원체 대사 상태를 재구성하고 현실적인 생물 막 구조의 형성을 허용하는 호스트 모방 모델에서 AST의 구현.

우리는 이전에 합성 CF 가래에 배양하고 P. aeruginosa 또는 S. 아우레우스에감염된 돼지 기관지의 부분을 포함하는 CF 생물막 모델을 개발했습니다. 감염되지 않은 EVPL은 7일 동안 정상적인 조직병리학을 유지하지만, P. aeruginosa 및 S. 아우레우스의 실험실 또는 임상 분리는 조직 주위의 생체내 유사 골재로 재현가능하게 형성되어 CF 감염21,22,23의병인학을 모방한다. 우리는 CF를 위한 맞춤형 바이오필름 AST 플랫폼으로서 이러한 높은 타당성, 고처리량 모델을 사용하기 위한 프로토콜을 제시하며, 모델에서 재배할 때 임상적으로 사용되는 항생제에 대한 병원균 생물막의 높은 내성을 보여주는 모범적인 결과를 제시한다. 이 모델은 생물막 형성의 관리 또는 예방을 위한 연구, 개발 파이프라인및 잠재적으로 진단 AST에 쉽게 통합될 수 있습니다. 사용되는 대부분의 장비(재료표 참조)는 비드 비터가 필수적이지만 일반적인 미생물학 실험실에서 쉽게 발견될 수 있으며, 적절한 자외선 생식기 질 캐비닛도 조달해야 할 수도 있다는 협력자와 협력하여 발견했습니다. 폐는 상업 정육점 이나 아바토이르에서 공급되기 때문에, 모델은 윤리적 인 우려를 제시하지 않습니다.

Protocol

이 프로토콜은 인간의 소비를 위해 고기를 공급하는 상업적인 아바토이르에서 공급되는 돼지 폐를 사용합니다. 영국 법률에 따라, 고기를 위해 도살 된 동물에게서 남은 조직을 사용하는 것은 윤리적 인 승인을 필요로하지 않습니다; 우리는 작업을 시작하기 전에 관련 지역 법률 및 기관 지침을 확인하는 독자를 조언한다. 1. 합성 CF 가래 미디어 준비 (SCFM) EVPL 조직과 함께 사용하기 위해 SCFM을 만들려면 Palmer 외24가 포도당이 레시피에서 제거되는 수정을 따르십시오.참고: Palmer et al.’s 레시피에는 CF 환자의 가래 샘플 에서 발견되는 평균 농도를 나타내는 농도에서 무료 아미노산, 양이온, 음이온 및 젖산이 포함되어 있습니다. P. aeruginosa PA14에 의한 쿼럼 감지 신호의 유사한 탄소 사용 경로 및 발현을 구해 주며, lyophilised 환자가래(24)로만든 배지의 성장에 대해 제시되고 있다. 1 L 수정 SCFM에 대한 조리법은 테이블 S1에제공됩니다. 필터는 준비 직후 SCFM을 살균하고 최대 1개월 동안 4°C에 보관합니다. 2. 전 비보 돼지 폐 (EVPL) 조직의 해부 및 감염 해부 전에 P. aeruginosa/S. 아우레우스 (예 : 리소게니 국물 + 1.2 % agar)에 대한 실험실에서 표준이 무엇이든을 사용하여 감염에 필요한 세균 균주 / s의 한천 플레이트 /s를 준비하십시오. 감염되지 않은 대조군 조직 조각을 포함하여 실험에 필요한 돼지 기관지 조직 조각을 계산합니다. 이 숫자를 2로 곱하여 두 개의 복제 폐에서 실험을 반복하여 결과의 반복성을 확인합니다. 400 μL/티슈 조각에 충분한 배지를 만들기 위해 아가로즈 패드를 만드는 데 필요한 SCFM 아가로즈(mL)의 부피를 결정하기 위해 0.5에 필요한 총 조직 조각을 곱하고 준비 중에 파이펫팅 오류 또는 증발을 고려하여 여분의 SCFM 천을 갖는다. 0.8%의 무게/볼륨 아가로즈로 SCFM의 원하는 총 부피를 만드는 데 필요한 SCFM의 15mL마다 0.12 g의 아가로즈를 추가합니다. 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 SCFM 아가로즈 용액을 가열합니다. 저전력에 국산 전자레인지를 권장합니다. 필요한 시간은 전자 레인지의 와트에 따라 달라집니다. 아가로즈가 약 50°C까지 식히도록 허용하십시오(터치에 따뜻하지만 편안하게 유지하십시오). 더 이상 식히지 마십시오. 파이펫을 사용하여 필요한 조직 조각 당 24웰 플레이트의 한 웰에 SCFM 아가로즈의 400 μL을 추가합니다. 자외선 아래 24웰 플레이트/s를 함유한 SCFM 아가로즈를 10분 간 살균합니다. 멸균 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)와 멸균 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640을 사용하여 해부되는 모든 그대로폐에 대해 3개의 복제 세차유를 50 μg/mL 암피실린으로 보충한다. 해부되는 모든 폐에 대한 최종 세척으로 40 mL SCFM의 알리쿼트합니다. 모든 세차스는 4°C에서 하룻밤 동안 저장하거나 즉시 사용할 수 있습니다. 도축 후 가능한 한 빨리 지정된 소스에서 폐를 확보하여 국내 냉각박스의 실험실로 이송하여 추위를 유지합니다.참고: 도살 당일에 가까운 폐는 저장에서 멍이 덜 보이지만, 도살에서 최대 4 일 동안 냉장 보관에 보관된 조직도 사용할 수 있습니다. 냉각상자를 정육점이나 아바토이르로 가져가야 하기 때문에, 각 사용 후 현지 실험실 지침에 따라 오염을 제거해야 하며 사용하지 않을 때 미생물학 실험실 외부에 보관하여 오염 의 위험과 봉쇄 위반을 줄여야 합니다. 멸균 된 표면과 화염 아래에서 작업, 오토클레이브 알루미늄 호일로 덮여 깨끗한 플라스틱 도마에 폐를 배치합니다. 기관지 가 그대로 유지 되어 있는지 확인 합니다. 아바토이르에서 또는 수송 중에 손상이 발생한 경우 폐는 사용하기에 적합하지 않습니다. 팔레트 나이프를 화염 밑에 가열하고 기관지 주변의 폐 부위에 칼을 아주 짧게 만져 조직의 표면을 살균합니다. 멸균 장착 면도날을 사용하여 기관지 주변의 표면 조직을 잘라냅니다. 손상을 방지하기 위해 기관지와 평행하게 절개를 합니다. 기관지가 노출되면, 기관지 확장기를 해제하기 위해 볼 수있는 가장 높은 지점에서 기관지 를 통해 단면 절개를합니다. 멸균 집게를 사용하여 기관지의 자유 끝을 가볍게 잡고 멸균 장착 면도날을 사용하여 남은 원치 않는 조직을 잘라냅니다. 어떤 분기가 폐에서 기관지 제거를 볼 수 있습니다 전에 기관지 전반에 걸쳐 최종 단면 절개를합니다. 첫 번째 DMEM/RPMI 1640 세척에 기관지 치올을 놓습니다. 세차 및 반복 단계 2.11-2.14에 기관지 치올을 두고 계획된 실험에 대한 충분한 조직 섹션을 산출하는 데 필요한 것과 동일한 폐에서 기관지의 추가 섹션을 수확한다. 동일한 폐에서 세척(2.16단계)에 추가 기관지 섹션을 배치합니다. 세탁시 2분 이상 그대로 둡니다. 첫 번째 DMEM/RPMI 1640 세척에서 기관지 치올레를 제거하고 멸균 페트리 접시에 샘플을 배치합니다. 멸균 포셉을 사용하여 각 기관지 포셉을 가볍게 잡고 조직을 손상시키지 않도록하십시오. 가능한 한 남아있는 연조직을 제거하고 멸균 해부 가위를 사용하여 조직을 ~ 5mm 너비의 스트립으로 자른다. 모든 기관지 티슈 스트립을 두 번째 DMEM/RPMI 1640 세척에 넣습니다. 세탁시 2분 이상 그대로 둡니다. 멸균 집게를 사용하여 두 번째 세척에서 조직 스트립을 제거하여 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 조직을 깨끗하고 멸균된 페트리 접시에 놓습니다. 기관지에 부착 된 나머지 연조직을 제거하고 멸균 해부 가위를 사용하여 스트립을 사각형 (~5mm x 5mm)으로 자른다. 페트리 접시에 세 번째 DMEM /RPMI 1640 워시를 추가합니다. 접시를 소용돌이에 의해 세척에 티슈 조각을 가볍게 섞는다. 페트리 접시에서 세 번째 세척을 부은 후 티슈 조각을 제거합니다. 조직 함유 페트리 접시에 최종 SCFM 세척을 추가하여 모든 조직 조각이 덮여 있는지 확인합니다. UV 빛 아래에서 SCFM의 티슈 조각을 5분 동안 살균합니다. 멸균 집게를 사용하여 멸균 된 각 기관지 조직 조각을 SCFM 아가로즈 패드가 들어있는 24 웰 플레이트 / s의 개별 우물로 옮겨 넣습니다. 각 조직 조각을 원하는 세균균균제로 감염시키기 위해 멸균 0.5 mL 인슐린 주사기에 부착된 29G 바늘의 끝으로 한천 판에서 자란 콜로니를 만드세요. 그런 다음 조직 조각에 식민지를 터치하여 조직 표면을 부드럽게 찌릅니다.참고: 29G 바늘이 장착된 인슐린 주사기를 사용하면 바늘을 정확하고 편안하게 유지하면서 손가락이 바늘과 폐 조직 모두에서 안전한 거리를 유지할 수 있습니다. 주사기에 부착되지 않은 29 G 바늘을 사용하여이 단계를 수행 할 수 있지만, 이것은 더 큰 손재주를 필요로하고 바늘 막대기 부상의 위험을 증가시킵니다. 인슐린 주사기를 쉽게 사용할 수 있습니다. 감염되지 않은 컨트롤의 경우, 멸균 0.5 mL 인슐린 주사기에 부착된 29 G 바늘의 끝으로 각 조직 조각의 표면을 부드럽게 찌릅니다. 파이펫을 사용하여 각 웰에 500 μL의 SCFM을 추가합니다. 10 분 동안 자외선 아래 각 24 웰 플레이트에 대한 통기성 밀봉 멤브레인을 살균(재료의 표). 24웰 플레이트/s에서 뚜껑/s를 제거하고 통기성 멤브레인으로 교체하십시오. 원하는 인큐베이션 (감염) 시간에 대해 37 °C에서 플레이트를 흔들어주세요. 감염되지 않은 대조군 조각(오염 제어)에 접종된 병원균의 눈에 띄는 성장이 없는지 확인합니다.참고: 원하는 경우, 암피실린은 2.5단계에서 SCFM 아가로즈 패드에 첨가되고 2.30단계에서 SCFM을 20 μg/mL의 최종 농도로 덮을 수 있다. 이것은 P. aeruginosa 또는 S. 아우레우스 성장에 영향을 미치지 않고 폐에 대부분의 내인성 박테리아의 성장을 억제할 것입니다 그러나, ampicillin의 존재는 그밖 항생제에 감수성에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 독자는 시험하고 싶은 긴장 및 항생제에 따라서 이 선택을 하기 위하여 남겨집니다. 3. 항생제 효능의 결정 참고: 이 분석기의 단계를 자세히 설명하는 회로도는 그림 S1에제공됩니다. EVPL에 형성된 생물막의 항생제 내성을 측정하기 위하여는, 적어도 2개의 독립적인 폐에서 폐 조각의 세트를 복제하는 것은 해부 및 감염 도중 설치되어야 합니다. 한 세트의 조각은 부정적인 대조군 (항생제 치료 없음)을 위해 필요하며, 항생제의 각 농도를 테스트하려면 1 세트가 필요합니다. 48시간의 인큐베이션 후 감염되지 않은 조직 조각을 시각적으로 검사합니다. 돼지 폐에 내생박테리아의 일부 성장이 발생했을 수 있으며, 이러한 섹션 주위의 SCFM을 선도하여 혼탁증이 될 수 있습니다. 선택된 연구 종의 전형적인 성장이 관찰되는 경우(예를 들어, P. aeruginosa의청록색 색소 침착 진단), 신선한 폐로 실험을 다시 시작합니다. 감염되지 않은 조직 섹션이 세균성 성장을 최소화하거나 보여주지 않으면, 각각 항생제 없이 또는 폐 조직 조각당 잘 관심있는 항생제로 신선한 SCFM의 500 μL을 포함하는 24 웰 워시 플레이트 1 개와 24 웰 처리 플레이트 1개를 준비하십시오. 각 감염된 조직 조각을 화염 살균 된 집게로 인큐베이션 플레이트에서 제거하고, 세척 판의 신선한 우물에서 잠시 소용돌이하여 비 생물막 관련 세균 세포를 제거하고, 치료 판의 적절한 우물로 옮춥니다. 신선한 통기성 멤브레인으로 처리 플레이트를 밀봉하십시오. 18-24 h에 대해 흔들리지 않고 37 °C에서 처리 플레이트 /s를 배양합니다. 화염 살균 포셉을 사용하여, 24웰 플레이트에서 각 폐 조각을 제거하고 인산완충식염수(PBS) 및 금속 구슬 1g(재료표)의 1mL을 함유한 멸균 2mL 균질화 튜브에넣습니다. 비드는 4m/s에서 40초 동안 이겼습니다.참고: 재료의 표에 제안된 특정 구슬 및 균질화로 구타하는 구슬은 박테리아의 중요한 은해를 일으키는 원인이 되지 않습니다, 그러나 프로토콜을 사용하여 각 실험실은 AST 분석서를 시작하기 전에 그들의 선택한 구슬 및 균질화제의 효력을 확인해야 합니다. 리소제니 국물(LB) 한천에 PBS 와 플레이트를 사용하여 폐 균질을 연속적으로 희석하여 표준 도금 방법에 따라 개별 치료 및 항생제 처리 조직 조각에서 콜로니 형성 유닛(CFU)을 결정합니다.참고: 선택 사항: 선택적 미디어에 중복 플레이트를 준비하여 식민지 정체성을 확인합니다. 예를 들어, S. 아우레우스에매니톨 소금 한천을 사용하소서.

Representative Results

EVPL 모델은 높은 처리량 분석 플랫폼을 제공하여 한 번에 항생제 감수성에 대한 많은 수의 세균 성 격리를 검사하거나 한 실험(그림 3)에서항생제 농도의 범위에 대한 균주를 선별 할 수 있게합니다. 연습을 통해 약 200개의 기관지 조직 섹션이 2시간 안에 폐에서 제조될 수 있다는 것을 발견했습니다. AST에 대한 전체 실험은 정상적인 근무 시간 내에 완료할 수 있습니다. 슈도모나스 아에루기노사및 황색포도상구균의 성장은 모델에서 48h 바이오필름의 제조를 분리하고, 실행 가능한 세포 수에 의해 모니터링될 때 일관된 세균부하(그림1 및 2)를생성한다. EVPL에서 자란 슈도모나스와 황색포도상구균의 조직 관련 생물막의 이미지는 우리의 간행물21,23에서빛 현미경 검사법과 조직 학적 염색을 위한 준비를 위한 프로토콜과 함께, 찾아낼 수 있습니다. 그러나, CFU 카운트의 재현성은 다른 세균성 종에 따라 다릅니다. 이는 ANOVA25이후 표준 반복성 계산을 사용하여 정량화될 수 있습니다. 우리는 P. aeruginosa에대 한 보다 S. aureus에 대 한 복제 폐 샘플에 CFU 사이 일반적으로 더 큰 차이가 발견. 실험실에 의해 모델을 채택할 때 실험 기술을 최적화하고 최종 실험에 사용되는 샘플 크기를 결정하기 위해 파일럿 실험에서 반복 계산이 수행되는 것이 좋습니다(이 예는 Sweeney et al26에대한 데이터 보충에서 찾을 수 있음). EVPL에서 성장하면, P. aeruginosa 및 S. 아우레우스의 생물막은 표준, 업계 승인 된 국물 MIC(도 1)및 표준 미디어를 사용하여 디스크 분석에 비해 항생제에 대한 내성이 증가함을 입증합니다(그림2). EVPL 에 대한 상이한 항생제의 다양한 효과는 구별할 수 있으며, 예를 들어 P. aeruginosa 살상은 EVPL에서 4-16X MIC ciprofloxacin으로 달성되지만 4-8X MIC 클로람페니콜(그림1)으로는달성되지 않습니다. 600 mg linezolid의 두 번 매일 복용량은 민감성 병원체 (4 μg/mL)27에 대한 MIC90 위의 혈청 농도를 달성하고 불리한 부작용 없이 적절한 노출로간주됩니다(28). 그림 2에 제시된 데이터는 디스크 분석에서 라인졸리드에 취약한 S. 아우레우스 인구가 EVPL에서 표적 혈청 농도 및 더 높은(12 μg/mL)에서 살아남을 수 있음을 보여줍니다. P. aeruginosa (그림 1)에대한 EVPL 성장 생물막에 MIC와 항생제 효과 사이에 명확한 상관 관계가 없습니다. 생체 내 항생제 내성의 보다 정확한 측정을 얻는 것은 항생제의 최적 투약이 만성 감염에 있는 저항을 위한 선택의 리스크를 증가시킬 수 있기 때문에 중요합니다. 생막 의 성장 모드는 항생제에 대한 세균 성 감수성을 크게 감소시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다. 이로 인해 많은 체외 생체막 어약이 개발되고 최소 생체막 박멸 농도(MBEC)14,15 대신 MIC대신 만성 감염의 감수성을 보다 정확하게 예측하는 것으로 이어졌다. SCFM의 사용 (다양한 제형에서) 또한 MIC 또는 MBEC 테스트29에사용하기 위해 권장되고있다. 여기서 우리는 심지어 최적화 된 체외 분석조차도 EVPL에서 colistin에 대한 P. aeruginosa 감수성을 정확하게 예측할 수 없다는 것을 보여줍니다. EVPL 성장 박테리아의 3 로그10 살인을 달성하는 데 필요한 항생제의 양은 종종 이러한 분석기(그림3)에SCFM이 사용되는 경우에도 표준 시험관 내 분석에서 계산된 MIC 또는 MBEC보다 훨씬 높다. 이는 체외 생체막 감수성 검사의 현재 구현이 표준 감수성테스트(16)에비해 CF에서 항생제 처방에 대한 예측 능력을 증가시키지 않는다고 보고한 Cochrane 검토와 일치한다. 또한 시간이 지남에 따라 생물막 박테리아에 대한 항생제의 영향을 평가하기 위해 모델을 사용하는 것은 간단하며, 폐의 충분한 복제 조각은 파괴적인 샘플링을 허용하도록 접종 될 수 있습니다. 항균제 간의 차이를 구별하는 것 외에도, 이 모델은 생물막의 다른 세균 성장 단계 또는 나이에 대한 감수성의 변화와 다른 항생제 투약 간격을 강조할 수 있습니다. 도 4는 P. 아루기노사 생물막이 성숙함에 따라 메로템에 대한 허용오차가 증가하고 있음을 보여준다. 이것은 새로운 에이전트의 효험을 결정하기 위하여 유용할 수 있었습니다, 예를 들면 급속한 세포 분열 도중 더 효과적인지. 또한 결과에 영향을 미치는 나이를 피하기 위해 생물막 시대를 표준화하고 검증해야 할 수 있으므로 실험의 제약 조건을 설정할 때 중요한 고려 사항이 될 수 있습니다. 도 5에서, S. 아우레우스 생존은 플루클로사실린에 대한 4시간 및 24시간 후 노출로 측정되었고, 세균세포 수에 대한 감소의 차이를 관찰할 수 있었다. 예를 들어 약동및 약동성 파라미터를 정의하거나 새로운 에이전트의 행동 모드를 해명할 때 약물 개발에 유용할 수 있습니다. 세균 부하의 변화는 종종 확장 된 배양 시간증가. 이는 48h 생물막 발병 후 도 5에서 처리되지 않은 대조군에서 볼 수 있으며, 항생제 투여 간격을 고려하여 24시간 이상의 노출을 알 수 있다. 변형은 모델에 내재되어 있습니다. 각 폐 샘플은 다른 사람으로부터 독립적이며 폐의 자연적인 변이를 반영합니다. 따라서 유효성 검사와 결과의 정확한 해석을 허용하기 위해 충분한 수의 복제가 포함되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 독자를 다시 추천하여 강력한 샘플 크기를 선택할 수 있도록 데이터에 대한 반복 계산을 수행합니다. 단순성, 우리는 각 실험에서 폐의 단 한 쌍에서 얻은 복제 조직 단면도에서 취한 대표적인 데이터를 제출했습니다, 그러나 실제로 복제동물에서 취한 조직 단면도에 반복적인 실험을 능력을 발휘할 필요가 있습니다. 이것은 개별 돼지 사이 어떤 생물학 변이를 설명하기 위하여 행해야 하며, 우리는 복제 돼지에서 취한 조직 사이에서 결과가 얼마나 일관적일 수 있는지, 그리고 이 변이가 분산(ANOVA)/일반 선형 모델(GLM)21,26의분석을 사용하여 데이터의 통계적 분석에서 어떻게 설명되는지에 대한 예를 들어독자를 참조한다. 그림 1. 총 CFU의 총 CFU 11 CF 슈도모나스 아에루기노사 임상 분리는 항생제로 치료 후 EVPL 모델에서 회복되었다. EVPL 모델에서 P. aeruginosa의 항생제 치료의 대표적인 결과. 각 균주는 EVPL 조직에서 48h를 위해 재배한 다음 항생제(삼각형) 또는 PBS로 18h및 CFU/폐에 대한 대조군(circles)으로 옮겨졌으며 CFU/폐가 결정되었다. 표준 양이온 조정 MHB에서 결정된 적당한 항생제를 위한 MIC는 각 균주(x 축) 옆에 있는 괄호로 도시된다. 균주는 MIC 값을 증가시켜 정렬됩니다. 적절한 경우 t-테스트를 사용하여 데이터를 분석하고 Mann-Whitney U가 비 파라메트릭 데이터 집합에 대해 테스트했습니다. 항생제 치료 및 치료되지 않은 조직 사이의 유의한 차이는 별표(P < 0.05)에 의해 표시됩니다. A. EVPL 모델에서 재배된 P. aeruginosa 생물막에서 회수된 실행 가능한 수의 경우 64 μg/mL 클로람페니콜(가장 높은 MIC 값 기록)으로 처리되었습니다. 각 분리에 대해, 클로람페니콜 처리 및 처리되지 않은 조직 섹션 사이의 CFU의 표준화된 평균 차이는 코헨의 d를 사용하여 계산하였다. 표준 테스트에서 MIC 값과 코헨의 d(Spearman의 순위 상관관계, rs = 0.45, p = 0.16) B에 의해 측정된 EVPL 모델의 실행 가능한 셀 수의 감소 사이에는 상관관계가 없었습니다. EVPL 모델에서 재배된 P. 아루기노사 바이오필름의 결과는 64 μg/mL 시프로플로신(최고 MIC 값 기록)으로 처리하였다. 파선 아래값은 검색 한도 미만이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2. 8개의 황색포도상구균 의 총 CFU는 linezolid를 가진 처리에 따라 EVPL 모형에서 복구된 임상 격리. 각 균주는 EVPL 조직에서 48h를 재배한 다음 24시간 동안 라인졸리드(삼각형)로 옮겨지거나 대조군(원)으로 처리되지 않았다. 모든 균주는 EUCAST 지침30 (억제 영역 > 21mm)에 따라 표준 디스크 확산 분석기를 사용하여 linezolid에 민감한 것으로 나타났습니다. 적절한 경우 t-테스트를 사용하여 데이터를 분석하고 비파라메트릭 데이터집합(P < 0.05)에 대한 Mann-Whitney U 테스트를 실시했습니다. 항생제 치료와 치료되지 않은 사이의 유의한 차이는 균주 중 어느 것에 대해도 발견되지 않았습니다. 파선 아래값은 검색 한도 미만이었습니다. A. 4 μg/mL 라인졸리드로 처리된 EVPL 모델에서 S. 아우레우스 생물막의 결과(EUCAST 분류31에따른 민감/내성 임상 중단점). B. 12 μg/mL 라인졸리드로 처리된 EVPL 모델에서 S. 아우레우스 생물막의 결과(Sweeney et al23로부터재현된 데이터). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3. 실험실 균주 PA14 및 4 CF 임상 분리의 실행 가능한 슈도모나스 아에루기노사 세포 수는 colistin의 농도증가와 치료 후 EVPL 모델에서 회복. 각 균주는 EVPL 조직에서 48h를 위해 재배한 다음 18시간 동안 colistin에 노출되었다. 표준 양이온 조정 MHB 배지에서 결정된 MIC는 각 스트레인 이름 옆에 있는 괄호로 표시됩니다. 세로선은 두 미디어에서 값이 동일한 SED6을 제외한 MHB(솔리드) 및 SCFM(파선)으로 결정된 MBEC 값을 표시합니다. 채워지지 않은 데이터 포인트는 처리되지 않은 샘플(0 μg/mL colistin)(Sweeney et alal 26에서재현된 데이터)에 비해 CFU/lung의 ≥ 3-log10 감소를 초래한 테스트된 콜리신의 가장 낮은 농도를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4. 대표적인 가능한 슈도모나스 아에루기노사 세포는 EVPL 모델에서 24시간 이상 성장한 시간 경과로부터, 64μg/mL 메로펜을 가진 후속 치료에서 계산한다. 실험실 균주 P. aeruginosa PA14 및 3 CF 임상 분리는 x 축에 표시된 시간 동안 EVPL 조직에 성장한 다음, 24h에 대한 메라펜 (삼각형)으로 전송되거나 대조군 (원)으로 치료되지 않은 상태로 방치하였다. CFU/폐는 그 때 결정되었습니다. 양이온 조정 MHB 배지에서 결정된 MIC는 각 스트레인 이름 옆에 있는 괄호로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5. 대표적인 실행 가능한 황색포도상구균 세포는 EVPL 모형에 성장을 다음 24 시간 과정을 통해 5 μg/mL 플루클로사실린으로 취급된 다음 계산합니다. 대조균 ATCC29213 및 2개의 CF 임상 분리는 EVPL 조직에서 48h를 위해 재배한 후 플루클로사실린(삼각형)으로 옮겨지거나 4h 및 24h에 대한 대조군(원)으로 처리되지 않은 상태로 방치된 후 CFU/lung이 결정되기 전에(Sweeney et al23로부터재생된 데이터). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 S1. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.   표 S1. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.  

Discussion

전 생체 폐 모델은 높은 처리량과 저렴하고, 육류 산업에서 포스트 소비자 폐기물을 사용하기 때문에, 그것은 윤리적 인 우려를 제시하지 않습니다. 그것은 시험관 장 AST 플랫폼에서 현재 사용 가능한 것보다 더 나은 만성 감염 인간의 CF 기도를 모방하도록 설계되었습니다. 여기에 제시된 결과는 이러한 상황에서 항생제 감수성을 보다 정확하게 예측할 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜의 중요한 단계는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 보장합니다.

  1. 폐 시료의 도살, 수집 및 처리 사이에 일관된 시간과 저장 방법을 사용합니다. 도축 후 가능한 한 빨리 폐를 사용하고 오염 가능성을 최소한으로 유지하는 것이 중요합니다. 가능한 한 신선하지 않으면 폐에서 성장하는 실험 문화의 능력에 있는 다름이 관찰되었습니다.
  2. SCFM의 생산에 멸균을 유지하고 폐 조각의 해부가 필수적입니다. 건강한 폐는 멸균되지 않으므로 막증 박테리아의 존재는 만성 감염을위한 ‘자연’환경을 반영 할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 앞서 언급 한 바와 같이, 다종 인구 내의 세균성 상호 작용은 항생제에 결과 및 감수성을 변경할 수 있습니다, 그래서 오염을 피해야하고 폐는 사용하기 전에 살균되어야한다. 우리는 자외선 살균의 사용을 옹호, 그것은 변경 주석 조직 무결성을 일으키는 것으로 보이지 않는 것으로 보인다, 필요한 경우, 추가 항생제 세서히. 그러나, 항생제는 선택적인 압력을 도입해서 결과에 영향을 미칠 수 있고 시험 세균성 인구에 있는 유전자 발현을 바꿀 수 있기 때문에 주의해서 이용되어야 합니다.
  3. 모의 감염, 음성 제어 조직 샘플 및 세포 수 플레이트를 비 선택적, 풍부한 배지에서 재배하여 살균 중에 제거되지 않은 오염 물질 또는 문가지 박테리아의 성장을 강조하십시오. 이것은 AST에 이 박테리아의 어떤 충격든지 완화하기 위하여 필수적입니다. 중복 판이 식민지 식별 및 세포 열거 속도를 높이기 때문에 관심있는 유기체에 특정한 중복, 선택적 한천, 세포 수 플레이트를 생성하는 것도 도움이 됩니다.
  4. 모델을 처음 사용하고 박테리아의 새로운 균주 또는 유전자형으로 사용하여 조직 섹션 간의 생물막 CFU 변이를 평가할 때 파일럿 실험을 수행하여 최적의 실험 샘플 크기(예를 들어, 얼마나 많은 복제 조직 섹션에서 얻을 수 있는지)를 전력 계산을 사용하여 최적의 실험 샘플 크기(예를 들어, 얼마나 많은 복제 조직 섹션에서 얻을 수 있는지)를 선택할 수 있도록 합니다.
  5. 이 분석법은 48시간의 인큐베이션 과 비교적 일관된 생물막 하중(특히 P. aeruginosa)의형성 후 신속한 접종을 허용하므로 표준화되지 않은 접종을 사용합니다. 초기 생막 성장 단계에서 항균 효능을 분석하려면 ASM에 중단된 식민지 재배 박테리아의 표준화된 CFU로 접종하는 것을 고려하십시오. 우리는 판자 박테리아로 접종하는 것을 권장하지 않습니다: 초기 파일럿 실험은 이것이 믿을 수 있는 생물막 형성이 아닌 급성, 침략적인 성장으로 이끌어 내는 것을 보여주었습니다.

이 프로토콜은 P. aeruginosa와함께 사용하기위한 강력한 프로토 타입 모델을 생성하며 S. aureus와함께 사용할 가능성이 크지만 향후 특정 응용 프로그램에 대해 해결해야 할 몇 가지 제한이 있습니다. 조직은 복제 인구의 발달을 허용하기 위하여 단 하나 식민지에서 접종되었습니다. 결과는 P. aeruginosa에대 한, 이것은 48 h에서 세포 수에 거의 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 그러나, 세균 부하의 더 큰 가변성은 S. 아우레우스에 대해 관찰되었고, 상이한 박테리아가 모델 내에서 다르게 성장할 수 있다는 점을 감안할 때, 동일한 크기와 무게의 조직 샘플의 표준화된 시작 접종 및 엄격한 생산은 연구 유기체에 의존할 수 있다. 또한 정밀한 해부/감염 기술 또는 현지 돼지 품종/토지의 차이로 인해 실험실 간에 차이가 있을 수 있습니다. 모델의 개별 구현을 위한 세균 집단의 재현성을 평가하기 위해결과(25)의 통계 분석의 일환으로 반복성 계산의 사용과 파일럿 실험을 기반으로 반복성/전력 계산을 사용하여 최종 실험에서 사용하기 위한 최적의 샘플 크기를 계산하는 것이 좋습니다.

전통적인 플레이트 분석에 비해 EVPL의 주요 장점 중 하나는 플랑크톤 또는 무생물 표면에서 성장하는 박테리아에 대한 테스트보다는 숙주 환경 내에서 세포 분화와 함께 세균 생물막의 공간 구조화를 허용한다는 것입니다. 이것은 항균제의 활동에 대한 물리화학적 및 영양 분과의 영향뿐만 아니라 만성 감염 및 박테리아 간의 세포 상호 작용 내의 다른 마이크로 환경에서 활성 치료의 전달 및 가용성을 고려하기위한 중요한 의미가 있습니다. 이 후자의 점은 특히 중요, 다종 감염은 정기적으로 CF에서 관찰 되 고 천식과 만성 폐쇄성 폐 질환 등 다른 호흡기 조건과 관련 된 감염에 점점 중요 해지고 있다. 임상 진단에서 개별화된 환자 가래 샘플링을 위한 AST를 위한 이 모형을 개발할 가능성이 있습니다. 만성 상처 (텍사스 주 러벅의 사우스 웨스트 지역 상처 관리 센터, R. Wolcott 박사)에서 신부에 있는 생물막의 성장과 AST를 위한 체외 모형에 상처를 모방하는 유사한 예심은 이미 진행되고 있습니다.

더욱이, 모델은 사후 조직을 사용하므로 항생 감수성에 대한 숙주 면역 반응의 영향은 제한적입니다. 현재 시험관 내 모델은 호스트 면역 반응을 고려하지 않으므로 AST 응용 프로그램에서 모델의 향후 사용에 대한 장벽으로 볼 수 없습니다. 그러나, 면역 반응은 약동성 및 약동성 파라미터 및 항생제 투여 지침이 결정될 때 고려됩니다. 우리의 연구는 조직 내의 잔여 면역 세포 및 반응의 증거를 보여 주었지만(및 S. Azimi, 개인 통신), 이것은 생체 내 조건에 더 큰 일치가 바람직한 경우 모델의 추가 최적화 및 개발을위한 주요 영역입니다.

CF를 위해 더 임상적으로 유효한 AST를 제공하는 것은 영국 건강, 사회 배려 법 2008의 중요한 권고를 충족하는 데 도움이 될 것입니다 “절차는 신중한 처방 및 항균 청지기 서비스를 보장하기 위해 장소에 있어야합니다.” 우리는 EVPL이 이러한 요구를 충족하는 데 도움이 이상적인 후보 모델이라고 생각합니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 우리가 모범적인 결과를 취한 원래 논문에 대한 모든 공동 저자에게 감사드립니다. 이 작업은 FH에 수여 된 MRC 새로운 조사자 연구 보조금 (교부금 번호 MR / R001898/1)에의해 지원되었습니다. NEH 및 IA에 수여 된 BBSRC 미들랜즈 통합 생물 과학 교육 파트너십 (MIBTP)에서 박사 과정 학생에 의해; 그리고 워릭 대학 학부 연구 지원 계획의 여름 휴가 연구 프로젝트를 수행하기 위해 FA에 수여. 우리는 스티브 퀴글리, 아들 (Cubbington, 워릭셔)과 존 테일러, 아들 (얼스덴, 코번트리)에게 폐를 공급해 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 세리스 해리스와 캐롤라인 스튜어트, 워릭 항균 검사 시설에서 아니타 캐서우드의 도움으로 워릭 대학의 생명 과학 대학의 미디어 준비 시설의 도움을 인정하고 싶습니다.

Materials

0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached
24-well culture plates
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium)
Agarose
Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs.
Bead beater designed to take 2 mL tubes MP Biomedicals 116004500 FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates Diversified Biotech BEM-1 or BERM-2000
Bunsen burner 
Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol.
Coolbox to transport lungs to lab
Dissection scissors in different sizes
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) 
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes  Thermo Fisher 15545809
Fisherbrand 2.38 mm metal beads Thermo Fisher 15505809
Germicidal UV cabinet
Insulin syringes -  0.5 mL with 29G needle attached. VWR BDAM324892
Large pallet knife
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate
Mounted razor blades
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit Thermo Fisher 10474415 For filter-sterilizing SCFM
Petri dishes
Phosphate-buffered saline
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
SCFM ingredients as listed in Table S1
Selection of forceps (blunt tips recommended)
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required.
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies.
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References

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Harrington, N. E., Sweeney, E., Alav, I., Allen, F., Moat, J., Harrison, F. Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (167), e62187, doi:10.3791/62187 (2021).
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