يمكن استخدام سير العمل هذا لإجراء اختبار قابلية المضادات الحيوية باستخدام نموذج الجسم الحي السابق الراسخ للبيو فيلم البكتيري في رئتي الأفراد المصابين بالتليف الكيسي. استخدام هذا النموذج يمكن أن تعزز الصحة السريرية لل MBEC (الحد الأدنى من تركيز الاستئصال بيو فيلم) المقايسات.
إن الوصفة الفعالة للمضادات الحيوية للأغشية الحيوية البكتيرية الموجودة داخل رئتي الأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) محدودة بسبب ضعف الارتباط بين نتائج اختبار قابلية المضادات الحيوية (AST) باستخدام طرق التشخيص القياسية (على سبيل المثال ، microdilution المرق ، نشر القرص ، أو Etest) والنتائج السريرية بعد العلاج بالمضادات الحيوية. تظهر محاولات تحسين AST من خلال استخدام منصات نمو بيو فيلم الجاهزة تحسنا طفيفا في النتائج. القدرة المحدودة لأنظمة بيو فيلم في المختبر لمحاكاة البيئة الفيزيائية الكيميائية للرئة CF، وبالتالي علم وظائف الأعضاء البكتيرية والهندسة المعمارية بيو فيلم، كما يعمل كفرامل على اكتشاف علاجات جديدة لعدوى CF. هنا، نقدم بروتوكولا لأداء AST من مسببات الأمراض CF نمت ناضجة، في بيو فيلم حي مثل فيفو في نموذج الرئة السابق فيفو CF تتألف من أنسجة الشعب الهوائية الخنزير والبلغم CF الاصطناعية (ex vivo خنزير الرئة، EVPL).
توجد العديد من المقايسات في المختبر لاختبار قابلية الأغشية الحيوية ، وذلك باستخدام إما المتوسط المختبري القياسي أو تركيبات مختلفة من البلغم CF الاصطناعية في لوحات microtiter. كل من النمو المتوسطة والركيزة بيو فيلم (لوحة البوليسترين مقابل الأنسجة القصبية) من المرجح أن تؤثر على التسامح المضادات الحيوية biofilm. نظهر التسامح المعزز من السريرية Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus أوريوس يعزل في نموذج الجسم الحي السابق; لا ترتبط آثار العلاج بالمضادات الحيوية من الأغشية الحيوية مع الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) في المقايسات microdilution القياسية أو تصنيف حساسة / مقاومة في المقايسات نشر القرص.
يمكن استخدام منصة الجسم الحي السابق ل AST بيو فيلم مفصل من عينات المرضى وكبرنامج اختبار معزز لعوامل أنتيبيو فيلم المحتملة أثناء البحث والتطوير الصيدلانية. تحسين وصفة طبية أو تسريع اكتشاف الأدوية antibiofilm من خلال استخدام أكثر في منصات الاختبار مثل الجسم الحي يمكن أن تحسن بشكل كبير النتائج الصحية للأفراد الذين يعانون من CF، فضلا عن خفض تكاليف العلاج السريري والبحوث الاكتشاف.
تؤثر العدوى المزمنة بالبيو فيلم على الأفراد الذين تتعرض دفاعاتهم المناعية العادية للخطر. وتشمل المجموعات المعرضة للخطر أولئك الذين يعانون من حالة وراثية التليف الكيسي (CF)1. استعمار سميكة بشكل غير طبيعي، مخاط لاصق في الجهاز التنفسي في مرحلة الطفولة المبكرة يؤدي إلى التهابات بيو فيلم مستعصية من القصيبات2،3. نمو البكتيريا والأغشية الحيوية واسعة النطاق مغلفة مصفوفة هو أحد العوامل التي تميز العدوى المزمنة من الناس منقوص المناعة من الالتهابات الحادة للمضيفين الأصحاء والدولة بيو فيلم على حد سواء يحمي البكتيريا من التعرض للمضادات الحيوية (بسبب انخفاض الانتشار من خلال المصفوفة) ويقلل من قابلية المضادات الحيوية (على سبيل المثال، من خلال تحريض من الهدوء أو upregulation من مضخات efflux)4،5. ومع ذلك، فإن التعديلات الخاصة بالأمراض في فسيولوجيا الأنسجة المضيفة والكيمياء تزيد من تغيير فسيولوجيا البكتيريا من تلك التي لوحظت في العدوى الحادة أو في ظروف نمو المختبر القياسية. ومن الأمثلة الرئيسية في CF استخدام مصادر الكربون غير العادية، مثل الأحماض الدهنية والأحماض الأمينية المنبعثة من السطحي الرئة وتنتج عن التدهور الميكروبي للموسين، وإطلاق المغذيات الدقيقة، مثل الحديد من الأنسجة التالفة، وداء الميكروبات6و7و8.
وبالتالي فإن الظروف الفيزيائية الكيميائية المحددة في سياق عدوى بيو فيلم معين يمكن أن تؤثر على الاستجابات للمضادات الحيوية. أولا، يعتمد هيكل وعمق المصفوفة خارج الخلية على الظروف البيئية المحلية، مثل المواد الغذائية أو قوى القص. ثانيا، يمكن أن تؤدي الإشارات البيئية إلى التعبير عن جينات محددة لمقاومة المضادات الحيوية. على سبيل المثال، فإن العامل الممرض CF Pseudomonas aeruginosa يظهر زيادة التعبير عن بيتا لاكتاماز وانخفاض التعبير عن البورين في البلغم CF مقابل في المختبر9،في حين أن آخر CF الممرض، Burkholderia cenocepacia،upregulates بيتا lactamases ومضخات efflux عندما تزرع في CF البلغم10. ثالثا، يمكن للظروف في المضيف أن تشير إلى تحول فسيولوجي أو وراثي إلى الأنماط الظاهرية التي تتحمل المضادات الحيوية، والتي يصعب تلخيصها في المختبر. وتشمل هذه المتغيرات مستعمرة صغيرة من المكورات العنقودية المكورات العنقودية المسببةللأمراضCF 11,12.
تشير جميع هذه البيانات إلى أنه عندما تعزل مختبرات التشخيص المستنسخين الفرديين عن البيو فيلم الإمراضي وتؤدي AST على الثقافات المزروعة العوالق أو لوحة أجار في وسائل الإعلام المختبرية القياسية (microdilution مرق، نشر القرص أو Etest)، والنتائج في كثير من الأحيان لا تتوقع المضادات الحيوية التي ستعمل فعلا في الجسم الحي. حتى لو تم استخدام المقايسات بيو فيلم في المختبر، فإنها قد لا جديلة في النمط الظاهري بيو فيلم في الجسم الحي مثل بسبب الاختلافات في سطح المتوسطة والمرفق المستخدمة، لذلك يمكن أن المقايسات باستخدام خلايا التدفق أو منصات microplate عالية الإنتاجية الإفراط في تقدير حساسية المضادات الحيوية13. وتنطبق نفس المشكلة على الباحثين في الأوساط الأكاديمية والصناعة الذين يسعون إلى تطوير عوامل جديدة مضادة للبيو فيلم: اختبار إمكانات المخدرات باستخدام منصات المختبر مثل خلايا التدفق، لوحات الميكروتر، أو مركز السيطرة على الأمراض مفاعلات بيو فيلم قد تعيين شريط فعالية بيو فيلم منخفضة جدا وتنتج إيجابيات كاذبة في البحث، وتطوير خط أنابيب.
العلاقة السيئة بين نتائج AST والنتيجة السريرية بعد العلاج بالمضادات الحيوية في CF معروفة جيدا. يتجاهل العديد من الأطباء ببساطة مختبر التشخيص AST حيث لا توجد إرشادات موحدة ومحددة CF لتفسير هذه النتائج وبدلا من ذلك يتخذون قرارات كل حالة على حدة للوصف. وقد بذلت محاولات لتحسين CF AST باستخدام جهاز بيو فيلم كالجاري، الذي يستخدم الأغشية الحيوية التي تزرع على سطح أوتاد بلاستيكية مجموعة داخل آبار لوحة صغيرة تحتوي على معيار AST المتوسطة (على سبيل المثال، cation المعدلة مولر-هينتون مرق)14،15. هذا المقايسة لا أفضل في التنبؤ المضادات الحيوية التي ستعمل في الجسم الحي من العوالق القياسية AST16. التأثير على المرضى الذين يعانون من CF صارخ. على الرغم من إعطاء المضادات الحيوية المتكررة (المضادات الحيوية المستنشقة العادية ومتوسط 27 يوما في السنة تلقي المضادات الحيوية عن طريق الوريد للأفراد الذين يعانون من CF في المملكة المتحدة)17، تؤدي نوبات متكررة وغير متوقعة من تفاقم الرئة الحاد إلى تلف الرئة التدريجي ، وفي حوالي 90٪ من الحالات ، تؤدي الوفاة بسبب فشل الجهاز التنفسي. في تحليل حديث ، كانت عدوى الرئة البكتيرية أقوى مؤشر على تكاليف الدواء في CF ، حيث أضافت في المتوسط 3.6K يورو / مريض / سنة إلى تكاليف الرعاية الصحيةالمباشرة 18،19.
بالنسبة للعدوى الحادة للأفراد الأصحاء ، فإن الأبحاث والسياسات الحالية التي تركز على AST السريع استنادا ، على سبيل المثال ، إلى التنبؤ الجينومي في نقطة الرعايةمثالية 20. ولكن في حالة الالتهابات المزمنة CF، فمن الواضح أن هناك حاجة إلى نهج مختلف: تنفيذ AST في نماذج محاكاة المضيف التي تلخص بشكل أفضل في بيئة الجسم الحي والحالة الأيضية المسببة للأمراض والسماح لتشكيل هيكل بيو فيلم واقعية.
لقد سبق لنا أن وضعت نموذج بيو فيلم CF التي تضم أقسام من قصبات الخنازير المحتضنة في البلغم CF الاصطناعية والمصابة P. aeruginosa أو S. أوريوس. EVPL غير المصابة يحتفظ الأمراض النسيجية العادية لمدة 7 أيام ولكن المختبر أو العزل السريري من P. aeruginosa و S. أوريوس شكل مستنسخ في المجاميع مثل الجسم الحي حول الأنسجة, محاكاة مسببات العدوى CF21,22,23. نحن نقدم بروتوكولا لاستخدام هذا النموذج عالي الصلاحية وعالي الإنتاجية كمنصة بيو فيلم AST مصممة خصيصا ل CF وتقديم نتائج مثالية تظهر التسامح العالي للأغشية الحيوية المسببة للأمراض للمضادات الحيوية المستخدمة سريريا عند زراعتها في النموذج. ويمكن دمج النموذج بسهولة في البحوث، وخطوط أنابيب التنمية لإدارة أو منع تشكيل بيو فيلم وربما في AST التشخيص. يمكن العثور على معظم المعدات المستخدمة (انظر جدول المواد) بسهولة في مختبر الميكروبيولوجيا النموذجي ، على الرغم من أن مضرب الخرز ضروري ، وقد وجدنا من العمل مع المتعاونين أن خزانة مبيدات الجراثيم فوق البنفسجية المناسبة قد تحتاج أيضا إلى شراء. وبما أن الرئتين مصدرها الجزارون التجاريون أو المسالخ، فإن النموذج لا يمثل أي مخاوف أخلاقية.
نموذج الرئة فيفو السابق هو الإنتاجية العالية وغير مكلفة، ولأنه يستخدم النفايات ما بعد المستهلك من صناعة اللحوم، فإنه لا يمثل أي مخاوف أخلاقية. وهي مصممة لمحاكاة الخطوط الجوية CF البشرية المصابة بشكل مزمن أفضل مما هو متاح حاليا، في منصات AST المختبر. تظهر النتائج المعروضة هنا أنه قد يتنبأ بدقة أكبر بقابلية المضادات الحيوية في ظل هذه الظروف.
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول، التي ستضمن نتائج موثوقة وقابلة للاستنساخ ما يلي:
هذا البروتوكول ينتج نموذج نموذج قوي للاستخدام مع P. aeruginosa, مع إمكانات كبيرة لتطوير للاستخدام مع S. أوريوس, ولكن لديها بعض القيود التي سوف تحتاج إلى معالجة لتطبيقات معينة في المستقبل. تم تلقيح الأنسجة من مستعمرات واحدة للسماح بتطور المجموعات السكانية اللاستنساخية. وتظهر النتائج أن, لP. aeruginosa, هذا له تأثير يذكر على أرقام الخلايا في 48 ح. ومع ذلك ، لوحظ تباين أكبر في الحمل البكتيري ل S. aureus ، وبالنظر إلى أن البكتيريا المختلفة قد تنمو بشكل مختلف داخل النموذج ، قد يعتمد الإنتاج الموحد بدءا والإنتاج الدقيق لعينات الأنسجة من الحجم والوزن المتماثلين على الكائن الحي للدراسة. قد تكون هناك أيضا اختلافات بين المختبرات بسبب الاختلافات في تقنيات التشريح الدقيق / العدوى أو سلالة الخنازير المحلية / سباق الأراضي. ولتقييم قابلية المجموعات البكتيرية للاستنساخ من أجل التطبيقات الفردية للنموذج، نقترح استخدام حسابات التكرار كجزء من التحليل الإحصائي للنتائج25 واستخدام حسابات التكرار/القدرة على أساس التجارب التجريبية لحساب الحجم الأمثل للعينة لاستخدامها في التجارب النهائية.
واحدة من المزايا الرئيسية للEVPL على المقايسات لوحة التقليدية هو أنه، بدلا من اختبار للبكتيريا تنمو العوالق أو على الأسطح اللاأحيائية، فإنه يسمح لهيكلة المكانية من الأغشية الحيوية البكتيرية داخل بيئة المضيف ومع تمايز الخلايا. وهذا له آثار هامة على النظر في تأثير التدرجات الفيزيوكيميائية والمغذيات على نشاط العوامل المضادة للميكروبات وكذلك تقديم وتوافر العلاجات النشطة في مختلف البيئات الدقيقة داخل عدوى مزمنة والتفاعل بين الخلايا الخلوية بين البكتيريا. وهذه النقطة الأخيرة هامة بشكل خاص، حيث لوحظت العدوى المتعددة الأنواع بشكل روتيني في CF وأصبحت ذات أهمية متزايدة للعدوى المرتبطة بحالات تنفسية أخرى، مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن. هناك إمكانية لتطوير هذا النموذج ل AST لأخذ عينات البلغم المريض الفردية في التشخيص السريري. وهناك تجربة مماثلة جارية بالفعل باستخدام نموذج محاكاة الجرح في المختبر للنمو و AST من بيو فيلم حطام من الجروح المزمنة (جنوب غرب مركز الرعاية الإقليمية للجروح في لوبوك، تكساس، الدكتور ر. وولكوت).
وعلاوة على ذلك، يستخدم النموذج أنسجة ما بعد الوفاة، وبالتالي فإن تأثير الاستجابة المناعية المضيفة على قابلية المضادات الحيوية محدود. النماذج الحالية في المختبر أيضا لا تمثل استجابات المناعة المضيف، لذلك نحن لا نرى هذا كحاجز أمام الاستخدام المستقبلي للنموذج في تطبيقات AST. ومع ذلك ، تؤخذ الاستجابة المناعية في الاعتبار عند تحديد المعلمات الدوائية والصيدلانية والمبادئ التوجيهية لدواسة المضادات الحيوية. على الرغم من أن دراساتنا قد أظهرت أدلة على الخلايا المناعية المتبقية والاستجابات داخل الأنسجة23 (وS. Azimi، الاتصالات الشخصية)، وهذا هو المجال الرئيسي لمزيد من التحسين وتطوير النموذج إذا كان من المرغوب فيه مباراة أكبر في ظروف الجسم الحي.
إن توفير المزيد من العلاج المضاد للأمراض الصالحة سريريا ل CF سيساعد في تلبية توصية رئيسية من قانون الرعاية الصحية والاجتماعية في المملكة المتحدة لعام 2008 بأن “الإجراءات يجب أن تكون قائمة لضمان الوصف الحصيف والإشراف على مضادات الميكروبات”. ونحن نعتقد أن EVPL هو نموذج مثالي للمرشح للمساعدة في تلبية هذه الحاجة.
The authors have nothing to disclose.
ونشكر جميع المشاركين في كتابتنا على الورقات الأصلية التي حصلنا منها على نتائج مثالية. تم تمويل العمل من خلال منحة أبحاث محقق جديد MRC (رقم المنحة MR/R001898/1)الممنوحة ل FH؛ من قبل طلاب الدكتوراه من BBSRC ميدلاندز شراكة التدريب التكاملي للعلوم الحيوية (MIBTP) الممنوحة لNEH وIA؛ وجائزة جامعة وارويك الجامعية خطة دعم البحوث إلى الاتحاد الانجليزي لإجراء مشروع بحثي عطلة الصيف. نشكر ستيف كويغلي وأولاده (كوبينغتون، وارويكشاير) وجون تايلور، سون (إيرلسدن، كوفنتري) على تزويد الرئتين. ونود أيضا أن نعترف بمساعدة مرفق إعداد وسائط الإعلام في كلية علوم الحياة في جامعة وارويك، مع شكر خاص لسيريث هاريز وكارولين ستيوارت، ومساعدة أنيتا كاثروود في مرفق وارويك لفحص مضادات الميكروبات.
0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached | |||
24-well culture plates | |||
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment | |||
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium) | |||
Agarose | |||
Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs. | |||
Bead beater designed to take 2 mL tubes | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system |
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates | Diversified Biotech | BEM-1 or BERM-2000 | |
Bunsen burner | |||
Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol. | |||
Coolbox to transport lungs to lab | |||
Dissection scissors in different sizes | |||
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | |||
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes | Thermo Fisher | 15545809 | |
Fisherbrand 2.38 mm metal beads | Thermo Fisher | 15505809 | |
Germicidal UV cabinet | |||
Insulin syringes - 0.5 mL with 29G needle attached. | VWR | BDAM324892 | |
Large pallet knife | |||
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate | |||
Mounted razor blades | |||
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit | Thermo Fisher | 10474415 | For filter-sterilizing SCFM |
Petri dishes | |||
Phosphate-buffered saline | |||
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface | |||
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | |||
SCFM ingredients as listed in Table S1 | |||
Selection of forceps (blunt tips recommended) | |||
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required. | |||
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies. |