Summary

Intravitreale Injektion und Quantifizierung von Infektionsparametern in einem Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis

Published: February 06, 2021
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Summary

Wir beschreiben hier eine Methode der intravitrealen Injektion und der anschließenden bakteriellen Quantifizierung im Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Immunantworten des Wirts und die bakterielle und die Genexpression zu messen.

Abstract

Intraokulare bakterielle Infektionen sind eine Gefahr für das Sehvermögen. Die Forscher verwenden Tiermodelle, um den Wirt und bakterielle Faktoren und Immunantwortwege im Zusammenhang mit Infektionen zu untersuchen, um lebensfähige therapeutische Ziele zu identifizieren und Medikamente zu testen, um Erblindung zu verhindern. Die intravitreale Injektionstechnik wird verwendet, um Organismen, Medikamente oder andere Substanzen direkt in die Glaskörperhöhle im hinteren Segment des Auges zu injizieren. Hier demonstrierten wir diese Injektionstechnik, um Infektionen im Mausauge und die Technik der Quantifizierung von intraokularen Bakterien zu initiieren. Bacillus cereus wurde 18 Stunden lang in flüssigen Medien des Gehirns angebaut und auf eine Konzentration von 100 Koloniebildenden Einheiten (CFU)/0,5 l resuspendiert. Eine C57BL/6J-Maus wurde mit einer Kombination aus Ketamin und Xylazin anbeet. Mit einem Pikoliter-Mikroinjektor und Glaskapillarnadeln wurde 0,5 l der Bacillus Suspension in den mittleren Glaskörper des Mausauges injiziert. Das kontralaterale Kontrollauge wurde entweder mit sterilen Medien injiziert (chirurgische Kontrolle) oder nicht injiziert (absolute Kontrolle). Nach einer Infektion nach 10 Stunden wurden Mäuse eingeschläfert und die Augen mit einer sterilen chirurgischen Pinzette geerntet und in ein Rohr mit 400 l sterilen PBS und 1 mm sterilen Glasperlen gelegt. Für ELISAs oder Myeloperoxidase-Assays wurde den Röhrchen ein Proteinase-Inhibitor zugesetzt. Für die RNA-Extraktion wurde der entsprechende Lysepuffer hinzugefügt. Die Augen wurden in einem Gewebehomogenisator für 1-2 Minuten homogenisiert. Homogenate wurden in PBS seriell 10-fach verdünnt und auf Agarplatten verdünnt. Der Rest der Homogenate wurde bei -80 °C für zusätzliche Tests gelagert. Die Platten wurden 24 Stunden lang inkubiert und die KBE pro Auge quantifiziert. Diese Techniken führen zu reproduzierbaren Infektionen in den Augen der Maus und erleichtern die Quantifizierung lebensfähiger Bakterien, der Wirtsimmunantwort und der Omics der Wirts- und bakteriellen Genexpression.

Introduction

Bakterielle Endophthalmitis ist eine verheerende Infektion, die Entzündungen verursacht und, wenn sie nicht richtig behandelt wird, zu Verlust des Sehvermögens oder Erblindung führen kann. Endophthalmitis resultiert aus dem Eindringen von Bakterien in das Innere des Auges1,2,3,4,5. Einmal im Auge, Bakterien replizieren, produzieren Toxine und andere schädliche Faktoren, und kann irreversible Schäden an empfindlichen Netzhautzellen und Gewebe verursachen. Augenschäden können auch durch Entzündungen verursacht werden, aufgrund der Aktivierung von entzündungshemmenden Bahnen, die zu einem entzündlichen Zellzufluss in das Innere des Auges führen1,5,6. Endophthalmitis kann nach intraokularer Operation (postoperative), einer durchdringenden Verletzung des Auges (posttraumatische) oder durch metastasierende Ausbreitung von Bakterien in das Auge von einer anderen anatomischen Stelle (endogen)7,8,9,10. Behandlungen für bakterielle Endophthalmitis umfasst Antibiotika, entzündungshemmende Medikamente, oder chirurgische intervention3,4,11. Auch mit diesen Behandlungen kann das Sehvermögen oder das Auge selbst verloren gehen. Die visuelle Prognose nach bakterieller Endophthalmitis variiert in der Regel je nach Wirksamkeit der Behandlung, der Sehschärfe bei der Präsentation und der Virulenz des infizierenden Organismus.

Bacillus cereus (B. cereus) ist einer der wichtigsten bakteriellen Krankheitserreger, die posttraumatische Endophthalmitisverursachen 7,12. Die Mehrheit der Fälle von B. cereus endophthalmitis hat einen schnellen Verlauf, der innerhalb weniger Tage zu Erblindung führen kann. Zu den Merkmalen von B. cereus Endophthalmitis gehören sich schnell entwickelnde intraokulare Entzündungen, Augenschmerzen, schneller Verlust der Sehschärfe und Fieber. B. cereus wächst schnell im Auge im Vergleich zu anderen Bakterien, die häufig Augeninfektionen verursachen2,4,12 und besitzt viele Virulenzfaktoren. Daher ist das Fenster für eine erfolgreiche therapeutische Intervention relativ kurz1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Behandlungen für diese Infektion sind in der Regel erfolgreich bei der Behandlung von Endophthalmitis durch andere weniger virulente Krankheitserreger verursacht, aber B. cereus Endophthalmitis führt häufig zu mehr als 70% der Patienten leiden an signifikanten Sehverlust. Etwa 50% dieser Patienten unterziehen evisceration oder Enukleation des infiziertenAuges 7,16,22,23. Die zerstörerische und schnelle Natur von B. cereus endophthalmitis erfordert eine sofortige und ordnungsgemäße Behandlung. Die jüngsten Fortschritte bei der Unterscheidung der zugrunde liegenden Mechanismen der Krankheitsentwicklung haben potenzielle Ziele fürInterventionen 19,26,27identifiziert. Experimentelle Mausmodelle von B. cereus Endophthalmitis sind weiterhin nützlich, um die Mechanismen der Infektion zu erkennen und potenzielle Therapeutika zu testen, die Sehverlust verhindern können.

Die experimentelle intraokulare Infektion von Mäusen mit B. cereus war ein instrumentelles Modell für das Verständnis von bakteriellen und Wirtsfaktoren sowie deren Wechselwirkungen während der Endophthalmitis28. Dieses Modell imitiert ein posttraumatisches oder postoperatives Ereignis, bei dem Bakterien während einer Verletzung ins Auge eingeführt werden. Dieses Modell ist sehr reproduzierbar und war nützlich für die Erprobung experimenteller Therapien und die Bereitstellung von Daten für Verbesserungen im Standard der Pflege1,6,19,29,30. Wie viele andere Infektionsmodelle ermöglicht dieses Modell eine unabhängige Kontrolle vieler Infektionsparameter und ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Untersuchung der Infektionsergebnisse. Studien in einem ähnlichen Modell bei Kaninchen in den letzten Jahrzehnten haben die Auswirkungen von B. cereus Virulenzfaktoren im Augeuntersucht 2,4,13,14,31. Durch die Injektion von B. cereus mutierten Stämmen ohne individuelle oder mehrere Virulenzfaktoren kann der Beitrag dieser Virulenzfaktoren zur Schwere der Erkrankung durch Ergebnisse wie die Konzentration von Bakterien zu verschiedenen Stunden der Postinfektion oder den Verlust der Sehfunktion13,14,27,31,32gemessen werden. Darüber hinaus wurden Wirtsfaktoren in diesem Modell untersucht, indem Knockout-Mausstämme ohne spezifische entzündliche Wirtsfaktoren26,29,33,34,35infiziert wurden. Das Modell ist auch nützlich für die Prüfung potenzieller Behandlungen für diese Krankheit durch Injektion neuer Verbindungen in das Auge nach der Infektion30,36. In diesem Manuskript beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das die Infektion eines Mausauges mit B. cereus,die Ernte des Auges nach der Infektion, die Quantifizierung der intraokularen bakteriellen Belastung und die Erhaltung von Proben umfasst, um zusätzliche Parameter der Krankheitsschwere zu untersuchen.

Protocol

Alle Verfahren wurden gemäß den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und der Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des University of Oklahoma Health Sciences Center (Protokollnummern 15-103, 18-043 und 18-087) genehmigt. 1. Sterile Glasnadeln Schalten Sie den Nadel…

Representative Results

Die Erzeugung eines reproduzierbaren Inokulums und die Genauigkeit des intravitrealen Injektionsverfahrens sind wichtige Schritte bei der Entwicklung von Modellen für mikrobielle Endophthalmitis. Hier haben wir das intravitreale Injektionsverfahren mit Gram-positivem Bacillus cereusdemonstriert. Wir injizierten 100 CFU/0,5 l B. cereus in die Mitte von fünf C57BL6-Mäusen. Nach 10 h Nachinfektion beobachteten wir ein intraokulares Wachstum von B. cereus auf ca. 1,8 x 105 KBE/Auge. <…

Discussion

Trotz der Verfügbarkeit von potenten Antibiotika, entzündungshemmenden Medikamenten und Vitrektomie-Chirurgie kann bakterielle Endophthalmitis einen Patienten blenden. Klinische Studien waren nützlich bei der Untersuchung von Endophthalmitis; Experimentelle Modelle der Endophthalmitis liefern jedoch schnelle und reproduzierbare Ergebnisse, die in Fortschritte im Standard der Versorgung übersetzt werden können, was zu einem besseren visuellen Ergebnis für die Patienten führt.

Das Glaskö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Feng Li und Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) für ihre Unterstützung. Unsere Forschung wurde von den Nationalen Gesundheitsinstituten R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 und R01EY024140 unterstützt. Unsere Forschung wurde auch durch P30EY21725 (NIH CORE Grant for Live Animal Imaging and Analysis, Molecular Biology, and Cellular Imaging) unterstützt. Unsere Forschung wurde auch durch das NEI Vision Science Pre-Doctoral Trainee Programm 5T32EY023202, ein Presbyterian Health Foundation Research Support Stipendium und ein uneingeschränktes Stipendium an das Dean A. McGee Eye Institute von Research to Prevent Blindness unterstützt.

Materials

2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L., Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O’Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

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Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

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