Summary

Intravitreale injectie en kwantificering van infectieparameters in een muismodel van bacteriële endoftalmitis

Published: February 06, 2021
doi:

Summary

We beschrijven hier een methode van intravitreale injectie en daaropvolgende bacteriële kwantificering in muismodel van bacteriële endoftalmitis. Dit protocol kan worden uitgebreid voor het meten van gastheer immuunresponsen en bacteriële en gastheer genexpressie.

Abstract

Intraoculaire bacteriële infecties vormen een gevaar voor het gezichtsvermogen. Onderzoekers gebruiken diermodellen om de gastheer- en bacteriële factoren en immuunresponstrajecten in verband met infectie te onderzoeken om levensvatbare therapeutische doelen te identificeren en om geneesmiddelen te testen om blindheid te voorkomen. De intravitreale injectietechniek wordt gebruikt om organismen, drugs of andere stoffen rechtstreeks in de glasholte in het achterste segment van het oog te injecteren. Hier hebben we deze injectietechniek aangetoond om infectie in het muizenoog te starten en de techniek van het kwantificeren van intraoculaire bacteriën. Bacillus cereus werd gekweekt in de hersenen hart infusie vloeibare media voor 18 uur en opnieuw geschorst tot een concentratie 100 kolonie vormen eenheden (CFU)/0.5 μL. Een C57BL/6J muis werd verdoofd met behulp van een combinatie van ketamine en xylazine. Met behulp van een picolitermicroinjector en glazen capillaire naalden werd 0,5 μL van de Bacillus-suspensie in het middenglas van het muizenoog geïnjecteerd. De contralaterale controle oog werd ofwel geïnjecteerd met steriele media (chirurgische controle) of werd niet geïnjecteerd (absolute controle). Na 10 uur na infectie werden muizen geëuthanaseerd en werden de ogen geoogst met steriele chirurgische pincet en in een buis geplaatst met 400 μL steriele PBS en 1 mm steriele glazen kralen. Voor ELISA’s of myeloperoxidasetesten werd eiwitaseremmer aan de buizen toegevoegd. Voor RNA-extractie is de juiste lysisbuffer toegevoegd. Ogen werden gehomogeniseerd in een weefsel homogenisator voor 1-2 minuten. Homogenaten werden serieel verdund 10-voudig in PBS en track verdund op agar platen. De rest van de homogenaten werd opgeslagen bij -80 °C voor extra tests. Platen werden 24 uur lang geïncubeerd en CFU per oog werd gekwantificeerd. Deze technieken resulteren in reproduceerbare infecties in de ogen van de muis en vergemakkelijken kwantificering van levensvatbare bacteriën, de gastheer immuunrespons, en omica van gastheer en bacteriële genexpressie.

Introduction

Bacteriële endoftalmitis is een verwoestende infectie die ontstekingen veroorzaakt, en, indien niet goed behandeld, kan resulteren in verlies van gezichtsvermogen of blindheid. Endophthalmitis is het gevolg van de binnenkomst van bacteriën in het binnenste van het oog1,2,3,4,5. Eenmaal in het oog, bacteriën repliceren, produceren toxines en andere schadelijke factoren, en kan onomkeerbare schade aan delicate netvliescellen en weefsels veroorzaken. Oculaire schade kan ook worden veroorzaakt door ontsteking, als gevolg van de activering van ontstekingstrajecten die leiden tot inflammatoire celinstroom in het binnenste van het oog1,5,6. Endophthalmitis kan optreden na intraoculaire chirurgie (postoperatieve), een doordringende verwonding aan het oog (posttraumatisch), of van gemetastaserende verspreiding van bacteriën in het oog van een andere anatomische plaats (endogene)7,8,9,10. Behandelingen voor bacteriële endophthalmitis omvatten antibiotica, ontstekingsremmende geneesmiddelen of chirurgische ingreep3,4,11. Zelfs met deze behandelingen, visie of het oog zelf kan verloren gaan. De visuele prognose na bacteriële endophthalmitis varieert over het algemeen afhankelijk van de effectiviteit van de behandeling, de gezichtsscherpte bij de presentatie en de virulentie van het infecterende organisme.

Bacillus cereus (B. cereus) is een van de belangrijkste bacteriële pathogenen die posttraumatische endophthalmitis7,12veroorzaakt . Een meerderheid van B. cereus endophthalmitis gevallen hebben een snelle cursus, die kan resulteren in blindheid binnen een paar dagen. De kenmerken van B. cereus endophthalmitis omvatten snel evoluerende intraoculaire ontsteking, oogpijn, snel verlies van gezichtsscherpte, en koorts. B. cereus groeit snel in het oog in vergelijking met andere bacteriën die vaak ooginfecties veroorzaken2,4,12 en bezit vele virulentie factoren. Daarom is het venster voor succesvolle therapeutische interventie relatief kort1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Behandelingen voor deze infectie zijn meestal succesvol in de behandeling van endophthalmitis veroorzaakt door andere minder virulente ziekteverwekkers, maar B. cereus endoftalmitis resulteert meestal in meer dan 70% van de patiënten die lijden aan aanzienlijk verlies van het gezichtsvermogen. Ongeveer 50% van deze patiënten ondergaan ontdaan of inappucleratie van het geïnfecteerde oog7,16,22,23. De destructieve en snelle aard van B. cereus endoftalmitis vraagt om onmiddellijke en juiste behandeling. De recente vooruitgang bij het onderscheiden van de onderliggende mechanismen van ziekteontwikkeling heeft potentiële streefcijfers voor interventie19,26,27vastgesteld . Experimentele muismodellen van B. cereus endophthalmitis blijven nuttig bij het onderscheiden van de mechanismen van infectie en het testen van potentiële therapieën die verlies van het gezichtsvermogen kunnen voorkomen.

Experimentele intraoculaire infectie van muizen met B. cereus is een instrumenteel model voor het begrijpen van bacteriële en gastheer factoren, evenals hun interacties, tijdens endophthalmitis28. Dit model bootst een posttraumatisch of postoperatief voorval na, waarbij bacteriën in het oog worden gebracht tijdens een verwonding. Dit model is zeer reproduceerbaar en is nuttig geweest voor het testen van experimentele therapieën en het verstrekken van gegevens voor verbeteringen in de standaard van de zorg1,6,19,29,30. Net als veel andere infectie modellen, dit model zorgt voor onafhankelijke controle van vele parameters van infectie en maakt efficiënt en reproduceerbaar onderzoek van infectie resultaten. Studies in een soortgelijk model bij konijnen in de afgelopen decennia hebben de effecten onderzocht van B. cereus virulentiefactoren in het oog2,4,13,14,31. Door b. cereus mutantstammen te injecteren zonder individuele of meervoudige virulentiefactoren, kan de bijdrage van deze virulentiefactoren aan de ernst van de ziekte worden gemeten aan de gevolgen zoals de concentratie van bacteriën op verschillende uren nainfectie of het verlies van visuele functie13,14,27,31,32. Bovendien zijn in dit model hostfactoren onderzocht door knock-outmuisstammen te infecteren zonder specifieke ontstekingsfactoren26,29,33,34,35. Het model is ook nuttig voor het testen van mogelijke behandelingen voor deze ziekte door het injecteren van nieuwe verbindingen in het oog na infectie30,36. In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol dat het infecteren van een muizenoog met B. cereusomvat, het oogsten van het oog na infectie, het kwantificeren van intraoculaire bacteriële belasting en het bewaren van specimens om extra parameters van de ernst van de ziekte te testen.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd naar aanleiding van de aanbevelingen in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en de Association for Research in Vision and Ofhthalmology Statement for the Use of Animals in Oogheelkundig en Vision Research. De protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center (protocolnummers 15-103, 18-043 en 18-087). 1. Steriele glazen naalden Zet de naaldpipettre…

Representative Results

Het genereren van een reproduceerbaar entmateriaal en nauwkeurigheid van de intravitreale injectieprocedure zijn belangrijke stappen in het ontwikkelen van modellen van microbiële endoftalmitis. Hier hebben we aangetoond dat de intravitreal injectie procedure met behulp van Gram-positieve Bacillus cereus. We injecteerden 100 CFU/0,5 μL B. cereus in het middenglas van vijf C57BL6 muizen. Na 10 uur nainfectie zagen we intraoculaire groei van B. cereus tot ongeveer 1,8 x 105 CFU/oog. …

Discussion

Zelfs met de beschikbaarheid van krachtige antibiotica, ontstekingsremmende geneesmiddelen en vitrectomiechirurgie, bacteriële endophthalmitis kan een patiënt blind maken. Klinische studies zijn nuttig geweest bij het bestuderen van endophthalmitis; echter, experimentele modellen van endoftalmitis bieden snelle en reproduceerbare resultaten die kunnen worden vertaald naar vooruitgang in de standaard van de zorg, wat resulteert in een betere visuele uitkomst voor patiënten.

Het glasvochtvolu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Dr. Feng Li en Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) voor hun hulp. Ons onderzoek is ondersteund door National Institutes of Health subsidies R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 en R01EY024140. Ons onderzoek is ook ondersteund door P30EY21725 (NIH CORE subsidie voor Live Animal Imaging and Analysis, Molecular Biology, en Cellular Imaging). Ons onderzoek is ook ondersteund door de NEI Vision Science Pre-doctoral Trainee programma 5T32EY023202, een Presbyterian Health Foundation Research Support subsidie, en een onbeperkte subsidie aan de decaan A. McGee Eye Institute van Research to Prevent Blindness.

Materials

2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L., Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O’Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Play Video

Cite This Article
Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

View Video