Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu
Summary
Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.
Abstract
Beyaz yağ dokusunun (WAT) stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) oldukça heterojendir ve yetişkinlikte WAT’ın genişlemesine ve yeniden şekillenmesine işlevsel olarak katkıda bulunan çok sayıda hücre tipinden oluşur. Bu hücresel heterojenliğin etkilerini incelemenin önündeki muazzam bir engel, in vitro ve in vivo analizler için işlevsel olarak farklı hücre alt popülasyonlarını WAT SVF’den kolayca izole edememektir. Tek hücreli dizileme teknolojisi, son zamanlarda yetişkin farelerin karın içi WAT depolarında fonksiyonel olarak farklı fibro-inflamatuar ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımlamıştır. Fibro-inflamatuar progenitörler (“FIP’ler” olarak adlandırılır), proinflamatuar bir fenotip uygulayabilen adipojenik olmayan kollajen üreten hücrelerdir. PDGFRβ+ adiposit öncü hücreleri (APC’ler), hücre transplantasyonu üzerine hem in vitro hem de in vivo olarak oldukça adipojeniktir. Burada, bu stromal hücre alt popülasyonlarının murin intraabdominal WAT depolarından izolasyonu için birden fazla yöntem tanımlanmıştır. FIP’ler ve APC’ler, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile veya biyotinile antikor bazlı immünomanyetik boncuk teknolojisinden yararlanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş hücreler moleküler ve fonksiyonel analiz için kullanılabilir. Stromal hücre alt popülasyonunun fonksiyonel özelliklerini izole olarak incelemek, hücresel düzeyde fizyolojik veya patolojik koşullar altında yağ dokusunun yeniden şekillenmesi hakkındaki mevcut bilgilerimizi genişletecektir.
Introduction
Beyaz yağ dokusu (WAT), memelilerde enerji depolamanın ana bölgesini temsil eder. Bu doku içinde, adipositler veya “yağ hücreleri”, büyük tek gözlü lipid damlacıkları halinde paketlenmiş trigliserit formunda fazla kaloriyi depolar. Ayrıca, adipositler, enerji homeostazınınçeşitli yönlerini düzenleyen çok sayıda faktör salgılar 1,2,3. Adipositler, WAT hacminin büyük kısmını oluşturur; bununla birlikte, adipositler, WAT 4,5’te bulunan toplam hücrelerin yalnızca %50’sinden daha azını temsil eder. WAT’ın adiposit olmayan bölmesi veya stromal-vasküler fraksiyon (SVF) oldukça heterojendir ve vasküler endotel hücreleri, dokuda yerleşik bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve adiposit öncü hücre (APC) popülasyonlarını içerir.
WAT, enerji depolama talebi arttıkça boyut olarak genişleme konusundaki olağanüstü kapasitesi açısından olağanüstüdür. Bu doku plastisitesinin korunması önemlidir, çünkü lipitlerin WAT’ta yeterli depolanması, adipoz olmayan dokulara zararlı ektopik lipid birikimine karşı koruma sağlar6. Bireysel WAT depolarının kalori fazlalığına yanıt olarak bu genişlemeye maruz kalma şekli, obezite ortamında insülin duyarlılığının kritik bir belirleyicisidir7. Metabolik sendromlu obez bireylerde gözlenen patolojik WAT genişlemesi, metabolik olarak uygun deri altı yağ dokusu pahasına viseral WAT depolarının tercihli genişlemesi ile karakterizedir. Ayrıca, obezitede insülin direnci, WAT’ın patolojik yeniden şekillenmesi ile ilişkilidir. Bu, mevcut adipositlerin hipertrofik büyümesi (boyutta artış), yetersiz anjiyogenez, kronik metabolik inflamasyon, hücre dışı matris bileşenlerinin birikimi (fibroz) ve doku hipoksisiile karakterizedir 8,9. Obezitenin bu WAT fenotipleri, lipodistrofi durumunda gözlenene benzer şekilde hepatik steatoz ve insülin direnci ile ilişkilidir (fonksiyonel WAT yokluğu). Buna karşılık, metabolik olarak sağlıklı obez popülasyonda sağlıklı WAT genişlemesi gözlenir ve koruyucu deri altı WAT’ın tercihli genişlemesi ve adiposit hiperplazisi10 yoluyla depo genişlemesi ile karakterize edilir. Yeni adipositlerin alımına, adiposit öncü hücrelerinden (APC’ler) (“adipogenez” olarak adlandırılır) de novo adiposit farklılaşması aracılık eder. Adiposit hiperplazisi, nispeten daha düşük derecelerde WAT fibrozu ve metabolik inflamasyon ile çakışır 6,11. WAT mikro çevresindeki çok sayıda hücre tipi, obezitede WAT’ın sağlığını ve genişletilebilirliğini doğrudan etkiler12. Bu nedenle, WAT’ta bulunan çeşitli hücre tiplerinin işlevini tanımlamak, alan için yüksek bir öncelik olmaya devam etmektedir.
Son on yılda, yerel APC’leri insan ve fare WAT SVF13’ten tanımlamak ve izole etmek için çeşitli stratejiler kullanılmıştır. Bu tür stratejiler, antikor bazlı hücre ayırma teknikleri kullanarak ortak mezenkimal kök / progenitör hücre belirteçlerinin hücre yüzeyi ekspresyonuna dayalı olarak APC’leri izole eder. Bu yaklaşımlar, florofor işaretli antikorlar kullanılarak floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasını (FACS) veya immünomanyetik boncuk ayrımını (yani kimyasal olarak modifiye edilmiş antikorlar) içerir. APC’lerin izolasyonu için hedeflenen hücre yüzey proteinleri arasında PDGFRα, PDGFRβ, CD34 ve SCA-1 bulunur. Bu yaklaşımlar APC’ler için zenginleştirmeye yardımcı oldu; Bununla birlikte, bu belirteçlere dayalı olarak izole edilen hücre popülasyonları oldukça heterojendir. Çok yeni tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) çalışmaları, murin WAT14,15,16,17’nin izole edilmiş stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) içindeki stromal hücrelerin moleküler ve fonksiyonel heterojenliğini vurgulamıştır. Kendi scRNA-seq ve fonksiyonel analizlerimizden, yetişkin farelerde intraabdominal WAT’ın stromal bölmesinde fonksiyonel olarak farklı bağışıklık modüle edici ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımladık ve karakterize ettik15. Fibro-inflamatuar öncüler veya FIP’ler, PDGFRβ+ hücrelerinin belirgin bir alt popülasyonunu temsil eder ve LY6C ekspresyonuna (LY6C + PDGFRβ+ hücreleri) dayalı olarak izole edilebilir15. FIP’ler adipojenik kapasiteden yoksundur, çeşitli uyaranlara güçlü bir pro-inflamatuar yanıt verir, kollajen üretir ve anti-adipojenik faktörler salgılar15. Bu hücrelerin pro-enflamatuar ve fibrojenik aktivitesi, farelerde obezite ile ilişkili olarak artar ve bu hücreleri WAT yeniden şekillenmesinin düzenleyicileri olarak gösterir. LY6C- CD9- PDGFRβ+ alt popülasyonu, adiposit öncü hücrelerini (APC’ler) temsil eder. Bu APC’ler, Pparg ve diğer pro-adipojenik genlerin ekspresyonu ile zenginleştirilir ve in vitro ve in vivo15 olarak olgun adipositlere kolayca farklılaşır. Burada, bu farklı hücre popülasyonlarının FACS kullanılarak yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından izolasyonu ve biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayrımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, yetişkin erkek ve dişi farelerin birden fazla karın içi WAT deposundan fonksiyonel olarak farklı adipoz progenitör alt popülasyonları izole etmek için kullanılabilir15. Bu fonksiyonel olarak farklı hücre popülasyonlarını izole edilmiş olarak incelemek, sağlık ve hastalıkta adipogenezi ve intraabdominal yağ dokusunun yeniden şekillenmesini düzenleyen moleküler mekanizmalar hakkındaki mevcut anlayışımıza büyük katkı sağlayabilir.
Aşağıdaki protokol, murin epididimal WAT’tan adipoz progenitörlerin izolasyonunu detaylandırmaktadır; bununla birlikte, aynı prosedür, hem erkek hem de dişi farelerin mezenterik ve retroperitoneal WAT depolarından karşılık gelen hücreleri izole etmek için kullanılabilir15. Farelerde bu depoların nasıl tanımlanacağı ve izole edileceğine dair ayrıntılı bir protokol Bagchi ve ark.18’de bulunabilir. Bu protokol, 6-8 haftalık farelerin kullanımı için optimize edilmiştir. APC’lerin sıklığı ve farklılaşma kapasitesi yaşlanma ile ilişkili olarak azalabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farelerin C57BL / 6 suşu, diyete bağlı obezite çalışmalarında en çok kullanılan fare türüdür. C57BL / 6 fareleri, yüksek yağlı bir diyete (HFD) yerleştirildiğinde hızla kilo alır ve obezite ile ilişkili metabolik sendromun bazı belirgin özelliklerini geliştirir (örneğin, insülin direnci ve hiperlipidemi). Özellikle, yüksek yağlı diyet (HFD) beslemesi ile ilişkili olarak meydana gelen WAT genişlemesi, depoya özgü bir şekilde gerçekleşir 19,20,21,22,23.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, mükemmel teknik yardımları için Lisa Hansen ve Kirsten Vestergaard’a ve el yazmasının eleştirel okuması için P. Scherer, N. Joffin ve C. Crewe’ye minnettardır. Yazarlar, burada açıklanan protokollerin geliştirilmesinde mükemmel rehberlik ve yardım için UTSW Akış Sitometrisi Çekirdeğine teşekkür eder. R.K.G., NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 ve NIDDK R01 DK119163 tarafından desteklenir. J.P., Danimarka İnovasyon Fonu’ndan bir doktora öncesi ödül ile desteklenmektedir.
Materials
| Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation | |||
| 40 and 100 µm cell strainers | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 5ml polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352053 | |
| Digestion Buffer (for 10mL) | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.) | Roche | 11088882001 | |
| 0.15 g BSA (1.5 % final cc.) | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs | |||
| 5X MojoSort Buffer (MS buffer) | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSort Magnet (MS magnet) | BioLegend | 480019 | |
| 100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480015 | |
| Purity Check and FACS | |||
| 10X Red Blood Cell Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Fc block (Mouse CD16/CD32) | eBioscience | 553141 | |
| Antibodies | |||
| Biotin CD45 | BioLegend | 103103 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| Biotin CD31 | BioLegend | 102503 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3 |
| Biotin CD9 | BioLegend | 124803 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Biotin LY6C | BioLegend | 128003 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD31-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 102419 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390 |
| CD45-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 103131 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| CD140b PDGFRβ-PE | BioLegend | 136006 | Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Cell Culture and Differentiation | |||
| Gonadal APC Culture media (for 500mL) | |||
| 288 mL DMEM with 1 g/L glucose | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 | Sigma | M6770 | |
| 10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 mL 100% ITS premix | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| 50 µL 100 g/ml FGF-basic | R&D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL Pen/Strep | Corning | 30-001-CI | |
| 500 µL Gentamycin | Gibco | 15750-060 | |
| **NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested. |
References
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
- Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
- Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
- Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
- Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
- Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324 (2009).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
- Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30 (2016).
- Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
- Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
- Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861 (2018).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
- Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890 (2018).
- Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
- Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).
