Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

El tejido adiposo blanco (WAT) representa el principal sitio para el almacenamiento de energía en los mamíferos. Dentro de este tejido, los adipocitos, o “células grasas”, almacenan el exceso de calorías en forma de triglicéridos, empaquetados en grandes gotas lipídicas uniloculares. Además, los adipocitos segregan multitud de factores que regulan diversos aspectos de la homeostasis energética ^1,2,3. Los adipocitos constituyen la mayor parte del volumen de WAT; sin embargo, los adipocitos solo representan menos del 50% del total de células encontradas en WAT ^4,5. El compartimento no adipocitario de WAT, o fracción estromal-vascular (SVF), es bastante heterogéneo y contiene células endoteliales vasculares, células inmunitarias residentes en tejidos, fibroblastos y poblaciones de células precursoras de adipocitos (APC).

WAT es excepcional por su notable capacidad de expansión de tamaño a medida que aumenta la demanda de almacenamiento de energía. El mantenimiento de esta plasticidad tisular es esencial, ya que el almacenamiento adecuado de lípidos en WAT protege contra la deposición ectópica deletérea de lípidos en tejidos no adiposos⁶. La forma en que los depósitos individuales de WAT experimentan esta expansión en respuesta al exceso calórico es un determinante crítico de la sensibilidad a la insulina en el contexto de la obesidad⁷. La expansión patológica de WAT, observada en individuos obesos con síndrome metabólico, se caracteriza por una expansión preferencial de los depósitos viscerales de WAT a expensas del tejido graso subcutáneo metabólicamente favorable. Además, la resistencia a la insulina en la obesidad se asocia con la remodelación patológica de la WAT. Se caracteriza por crecimiento hipertrófico de los adipocitos existentes (aumento de tamaño), angiogénesis inadecuada, inflamación metabólica crónica, acumulación de componentes de la matriz extracelular (fibrosis) e hipoxia tisular ^8,9. Estos fenotipos WAT de obesidad se asocian con esteatosis hepática y resistencia a la insulina, similar a lo que se observa en la condición de lipodistrofia (ausencia de WAT funcional). Por el contrario, la expansión saludable de la WAT se observa en la población obesa metabólicamente sana y se caracteriza por la expansión preferencial de la WAT subcutánea protectora y la expansión del depósito a través de la hiperplasia de los adipocitos¹⁰. El reclutamiento de nuevos adipocitos está mediado por la diferenciación de novo de los adipocitos a partir de las células precursoras de los adipocitos (APC) (denominada “adipogénesis”). La hiperplasia de los adipocitos coincide con grados relativamente más bajos de fibrosis WAT e inflamación metabólica ^6,11. Una multitud de tipos de células dentro del microambiente WAT influyen directamente en la salud y la capacidad de expansión de WAT en la obesidad¹². Como tal, la definición de la función de los diversos tipos de células presentes en WAT sigue siendo una alta prioridad para el campo.

Durante la última década, se han empleado varias estrategias para definir y aislar APC nativas de WAT SVF¹³ humano y de ratón. Estas estrategias aíslan las APC en función de la expresión en la superficie celular de marcadores comunes de células madre/progenitoras mesenquimales mediante técnicas de separación celular basadas en anticuerpos. Estos enfoques incluyen la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), el uso de anticuerpos marcados con fluoróforos o la separación inmunomagnética de perlas (es decir, anticuerpos modificados químicamente). Las proteínas de la superficie celular dirigidas para el aislamiento de APC incluyen PDGFRα, PDGFRβ, CD34 y SCA-1. Estos enfoques han ayudado a enriquecer a las APC; Sin embargo, las poblaciones celulares aisladas en base a estos marcadores son bastante heterogéneas. Estudios muy recientes de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) han puesto de manifiesto la heterogeneidad molecular y funcional de las células estromales dentro de la fracción estromal-vascular aislada (SVF) de WAT murino 14,15,16,17. A partir de nuestros propios análisis funcionales y de scRNA-seq, hemos identificado y caracterizado subpoblaciones de células perivasculares PDGFRβ+ adipogénicas inmunomoduladoras y adipogénicas funcionalmente distintas en el compartimento estromal del WAT intraabdominal en ratones adultos¹⁵. Los precursores fibroinflamatorios, o FIP, representan una subpoblación prominente de células PDGFRβ+ y pueden aislarse en función de la expresión de LY6C (células LY6C+ PDGFRβ+)¹⁵. Los FIP carecen de capacidad adipogénica, ejercen una fuerte respuesta proinflamatoria a diversos estímulos, producen colágeno y secretan factores antiadipogénicos¹⁵. La actividad proinflamatoria y fibrogénica de estas células aumenta en asociación con la obesidad en ratones, implicando a estas células como reguladoras de la remodelación de WAT. La subpoblación LY6C-CD9-PDGFRβ+ representa células precursoras de adipocitos (APC). Estas APCs están enriquecidas en la expresión de Pparg y otros genes pro-adipogénicos, y se diferencian fácilmente en adipocitos maduros in vitro e in vivo¹⁵. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de estas distintas poblaciones celulares de depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos utilizando FACS, y la separación inmunomagnética de perlas con anticuerpos biotinilados. Este protocolo se puede utilizar para aislar subpoblaciones progenitoras adiposas funcionalmente distintas de múltiples depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos machos y hembras¹⁵. El estudio de estas poblaciones celulares funcionalmente distintas de forma aislada puede contribuir en gran medida a nuestra comprensión actual de los mecanismos moleculares que regulan la adipogénesis y la remodelación del tejido adiposo intraabdominal en la salud y la enfermedad.

El protocolo a continuación detalla el aislamiento de los progenitores adiposos del WAT del epidídimo murino; sin embargo, el mismo procedimiento puede utilizarse para aislar las células correspondientes de los depósitos de WAT mesentérico y retroperitoneal de ratones machos y hembras¹⁵. Un protocolo detallado sobre cómo identificar y aislar estos depósitos en ratones se puede encontrar en Bagchi et ^al.18. Este protocolo ha sido optimizado para el uso de ratones de 6-8 semanas de edad. La frecuencia y la capacidad de diferenciación de las APC pueden disminuir en asociación con el envejecimiento.