Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini

Il tessuto adiposo bianco (WAT) rappresenta il sito principale per l’accumulo di energia nei mammiferi. All’interno di questo tessuto, gli adipociti, o “cellule adipose”, immagazzinano le calorie in eccesso sotto forma di trigliceridi, impacchettati in grandi goccioline lipidiche uniloculare. Inoltre, gli adipociti secernono una moltitudine di fattori che regolano vari aspetti dell’omeostasi energetica ^1,2,3. Gli adipociti costituiscono la maggior parte del volume di WAT; tuttavia, gli adipociti rappresentano solo meno del 50% del totale delle cellule presenti in WAT ^4,5. Il compartimento non adipocitario della WAT, o frazione stromale-vascolare (SVF), è piuttosto eterogeneo e contiene cellule endoteliali vascolari, cellule immunitarie residenti nei tessuti, fibroblasti e popolazioni di cellule precursori degli adipociti (APC).

WAT è eccezionale nella sua notevole capacità di espandersi in termini di dimensioni con l’aumento della domanda di accumulo di energia. Il mantenimento di questa plasticità tissutale è essenziale in quanto un’adeguata conservazione dei lipidi nel WAT protegge dalla deposizione deleteria di lipidi ectopici nei tessuti non adiposi⁶. Il modo in cui i singoli depositi WAT subiscono questa espansione in risposta all’eccesso calorico è un determinante critico della sensibilità all’insulina nel contesto dell’obesità⁷. L’espansione patologica del WAT, osservata in individui obesi con sindrome metabolica, è caratterizzata da un’espansione preferenziale dei depositi viscerali di WAT a scapito del tessuto adiposo sottocutaneo metabolicamente favorevole. Inoltre, l’insulino-resistenza nell’obesità è associata al rimodellamento patologico del WAT. Questo è caratterizzato da crescita ipertrofica degli adipociti esistenti (aumento delle dimensioni), angiogenesi inadeguata, infiammazione metabolica cronica, accumulo di componenti della matrice extracellulare (fibrosi) e ipossia tissutale ^8,9. Questi fenotipi WAT dell’obesità sono associati alla steatosi epatica e all’insulino-resistenza, in modo simile a quanto osservato nella condizione di lipodistrofia (assenza di WAT funzionale). Al contrario, l’espansione sana del WAT si osserva nella popolazione obesa metabolicamente sana ed è caratterizzata da un’espansione preferenziale del WAT sottocutaneo protettivo e dall’espansione del deposito attraverso l’iperplasia degli adipociti¹⁰. Il reclutamento di nuovi adipociti è mediato dalla differenziazione de novo degli adipociti dalle cellule precursori degli adipociti (APC) (definita “adipogenesi”). L’iperplasia degli adipociti coincide con gradi relativamente più bassi di fibrosi WAT e infiammazione metabolica ^6,11. Una moltitudine di tipi di cellule all’interno del microambiente WAT influenza direttamente la salute e l’espandibilità del WAT nell’obesit๲. Pertanto, la definizione della funzione dei vari tipi di cellule presenti nel WAT rimane una priorità assoluta per il campo.

Nell’ultimo decennio, sono state impiegate diverse strategie per definire e isolare APC native da WAT SVF¹³ umano e murino. Tali strategie isolano le APC in base all’espressione sulla superficie cellulare di comuni marcatori di cellule mesenchimali/cellule progenitrici utilizzando tecniche di separazione cellulare basate su anticorpi. Questi approcci includono la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), utilizzando anticorpi marcati con fluorofori o la separazione immunomagnetica delle microsfere (cioè anticorpi chimicamente modificati). Le proteine della superficie cellulare bersaglio per l’isolamento delle APC includono PDGFRα, PDGFRβ, CD34 e SCA-1. Questi approcci hanno contribuito ad arricchire le APC; Tuttavia, le popolazioni cellulari isolate sulla base di questi marcatori sono piuttosto eterogenee. Recentissimi studi di sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) hanno evidenziato l’eterogeneità molecolare e funzionale delle cellule stromali all’interno della frazione stromale-vascolare isolata (SVF) del WAT murino 14,15,16,17. Dalle nostre analisi funzionali e scRNA-seq, abbiamo identificato e caratterizzato sottopopolazioni di cellule perivascolari PDGFRβ+ adipogeniche immunomodulanti e adipogeniche funzionalmente distinte nel compartimento stromale del WAT intra-addominale in topi adulti¹⁵. I precursori fibro-infiammatori, o FIP, rappresentano una sottopopolazione importante di cellule PDGFRβ+ e possono essere isolati in base all’espressione di LY6C (cellule LY6C+ PDGFRβ+)¹⁵. Le FIP mancano di capacità adipogenica, esercitano una forte risposta pro-infiammatoria a vari stimoli, producono collagene e secernono fattori anti-adipogenici¹⁵. L’attività pro-infiammatoria e fibrogenica di queste cellule aumenta in associazione con l’obesità nei topi, implicando queste cellule come regolatori del rimodellamento del WAT. La sottopopolazione LY6C- CD9- PDGFRβ+ rappresenta le cellule precursori degli adipociti (APC). Queste APC sono arricchite nell’espressione di Pparg e di altri geni pro-adipogenici e si differenziano facilmente in adipociti maturi in vitro e in vivo¹⁵. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l’isolamento di queste distinte popolazioni cellulari da depositi WAT intra-addominali di topi adulti utilizzando FACS e separazione immunomagnetica delle microsfere con anticorpi biotinilati. Questo protocollo può essere utilizzato per isolare sottopopolazioni progenitrici adipose funzionalmente distinte da più depositi WAT intra-addominali di topi adulti maschi e femmine¹⁵. Lo studio di queste popolazioni cellulari funzionalmente distinte in isolamento può contribuire notevolmente alla nostra attuale comprensione dei meccanismi molecolari che regolano l’adipogenesi e il rimodellamento del tessuto adiposo intra-addominale in salute e malattia.

Il protocollo seguente descrive in dettaglio l’isolamento dei progenitori adiposi dal WAT dell’epididimo murino; tuttavia, la stessa procedura può essere utilizzata per isolare le cellule corrispondenti dai depositi WAT mesenterico e retroperitoneale di topi maschi e femmine¹⁵. Un protocollo dettagliato su come identificare e isolare questi depositi nei topi può essere trovato in Bagchi et ^al.18. Questo protocollo è stato ottimizzato per l’uso di topi di 6-8 settimane di età. La frequenza e la capacità di differenziazione delle APC possono diminuire in associazione con l’invecchiamento.